STAT3、MMP-2蛋白和mRNA在維吾爾族乳腺癌患者中的表達及意義*

周梅,阿迪拉·斯依提,葉明,岳娜,陳鈺煒,王書芹

1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院病理科(新疆烏魯木齊 830000)；2中山市中醫院病理科(廣東中山 528400)

乳腺癌已經成為全世界婦女的嚴重威脅，也是第二大致死原因。乳腺癌在全世界婦女每年發病率有100多萬[1]，而乳腺癌的遺傳學易感性和臨床預后存在著種族和地域差異[2]，近年維吾爾族乳腺癌發病率呈逐年上升趨勢，因此探尋維吾爾族乳腺癌的發生、發展機制具有重要意義。信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)是一種信號轉導和轉錄激活蛋白，可與酪氨酸磷酸化通道偶聯而被激活，磷酸化的STAT3可介導多種信號分子調控腫瘤增殖及凋亡，影響腫瘤的進展[3]。STAT3在多種惡性腫瘤中被激活，例如肺癌、胰腺癌和肝細胞性肝癌[4]，最近研究數據表明STAT3參與乳腺癌的進展、增殖、轉移和耐藥機制中。MMP-2(Ⅳ型膠原酶)是高度保守的依賴于鋅離子的內切蛋白水解酶，MMP-2在乳腺癌轉移中發揮著重要作用，研究表明STAT3介導的細胞轉移機制是通過上調MMP-2實現的[5-6]，STAT3和MMP-2與維吾爾族乳腺癌患者關系的報道較少，兩者的表達是否與其他民族存在差異尚未明確，本研究運用RT-PCR和免疫組化的方法檢測STAT3和MMP-2蛋白和mRNA在維吾爾族乳腺癌中的表達，分析其與乳腺癌各臨床病理指標間的關系，探討兩者在維吾爾族乳腺癌癌變過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年12月新疆醫科大學附屬腫瘤醫院病理科存檔乳腺蠟塊110例，其中維吾爾族乳腺癌80例，正常乳腺組織30例，所有病例均為女性，乳腺癌患者的年齡分布為27～81歲，平均(54±11.6)歲。病理類型均為非特殊類型浸潤性乳腺癌，乳腺癌的組織學分級及分期標準參照2012年世界衛生組織的標準。

1.2 主要試劑 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋。RNA提取試劑盒QIAquick PCR Purification Kit購自美國QIAGEN公司，逆轉錄試劑盒購自Promega生物公司，SYBR Real-Time PCR試劑盒購自大連Takara公司。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化 所有標本均經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預處理的載玻片上，將石蠟切片置于60℃烤箱烘烤2 h，將切片按濃度梯度浸入二甲苯和酒精脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復抗原4 min，加過氧化氫10 min，阻斷內源性過氧化物酶活性，切片用10%的山羊血清阻斷，STAT3(1∶100)、MMP-2(1∶150)稀釋抗體，一抗孵育2 h，二抗孵育30 min，DAB顯色，脫水，封片。

1.3.2 提取總RNA與合成cDNA 取樣本6片，厚6 μm，用RNA提取試劑盒(美國，QIAGEN)提取總RNA，測其純度(紫外分光法)，按逆轉錄試劑盒(Promega生物公司)說明書進行反轉錄，將500 ng總RNA加入20 μL反應體系中，經37℃ 15 min、85℃ 5 s、4℃延伸，獲得cDNA后行PCR檢測或冰箱(-20℃)保存備用。

1.3.3 RT-PCR檢測 檢測STAT3和MMP-2 mRNA的相對表達量，RT-PCR具體操作步驟按試劑盒說明書進行。反應體系：SYBR 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加入去離子水至20 μL；在實時熒光定量PCR儀上進行熱循環反應，PCR反應條件：95℃ 30 min預變性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，PCR循環40次；溶解并繪制溶解曲線：95℃ 5 s、60℃ 30 s、95℃ 。每份樣本設3個復孔，重復3次。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數，即Ct值。采用△Ct法計算乳腺癌組織和正常乳腺組織mRNA的相對表達量，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。引物由上海生工生物公司合成。STAT3上游引物：5′-CAGTGACCAGGCAGAAGA-3′，STAT3下游引物：5′-ACTCCATCGCTGACAAAA-3′；MMP-2上游引物：5′-ATAACCTGGATGCCGTCGT-3′，MMP-2下游引物：5′-AGGCACCCTTGAAGAAGTAGC-3′；內參GAPDH上游引物：5′-TCGACCAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，GAPDH下游引物：5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。

1.4 結果判定 STAT3蛋白陽性表達為胞核內出現棕黃色顆粒，MMP-2蛋白陽性表達為胞質出現棕黃色顆粒。陽性染色強度評分：無染色為0分，微弱染色為1 分，清晰染色且細胞質或細胞核呈棕黃色為2 分，細胞質與細胞核呈深棕色為3分；陽性細胞數評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞數≤20%為1 分，陽性細胞數21%～50%為2 分，陽性細胞數>50%為3分；上述兩項評分相乘，0～2分為陰性，≥3 分為陽性表達。

2 結果

2.1 檢測STAT3和MMP-2蛋白在維吾爾族乳腺癌和正常乳腺組織中的表達 采用免疫組化的方法檢測STAT3和MMP-2蛋白的表達，結果表明STAT3和MMP-2蛋白在乳腺癌組織中高表達。見圖1。STAT3蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率為77.5%，在正常乳腺組織中的陽性表達率為56.7%，STAT3蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)；MMP-2蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率為70%，而在正常乳腺組織中的陽性表達率為36.7%，MMP-2蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率也明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)。見表1。

表1 STAT3和MMP-2蛋白在維吾爾族乳腺癌和正常乳腺組織中的表達 例

2.2 STAT3和MMP-2蛋白在維吾爾族乳腺癌中表達的關系 在維吾爾族乳腺癌中，STAT3和MMP-2蛋白的表達具有較高的一致性，相關性分析顯示，STAT3和MMP-2蛋白的表達呈正相關(r=0.235，P<0.05)。見表2。

注：A：乳腺癌組織中STAT3的陽性表達；B：乳腺癌組織中MMP-2的陽性表達圖1 免疫組化染色(IHC，×100)

表2 維吾爾族乳腺癌組織STAT3和MMP-2蛋白表達的相關性分析 例

2.3 STAT3和MMP-2蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 在維吾爾族乳腺癌中，STAT3和MMP-2蛋白的陽性表達率與乳腺癌腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期均具有相關性(P<0.05)，腫瘤體積越大、組織學分級越高、有淋巴結轉移、TNM分期越高的乳腺癌STAT3和MMP-2蛋白的陽性表達率越高。見表3。

表3 維吾爾族乳腺癌組織STAT3和MMP-2蛋白表達與臨床病理特征的關系 例

2.4 比較STAT3和MMP-2 mRNA在維吾爾族乳腺癌組織與正常組織中表達的差異 STAT3和MMP-2 mRNA水平運用相對定量法通過2-ΔΔct計算。觀察溶解曲線及擴增循環圖，了解擴增情況。STAT3基因mRNA在維吾爾族浸潤性乳腺癌中的相對表達量明顯高于正常乳腺組織，差異有統計學意義(P<0.05)；MMP-2 mRNA在維吾爾族浸潤性乳腺癌中的相對表達量明顯高于正常乳腺組織，差異也有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 STAT3和MMP-2 mRNA在維吾爾族乳腺癌與正常乳腺組織中的相對表達量

2.5 比較STAT3和MMP-2 mRNA表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 RT-PCR結果顯示，STAT3 mRNA在乳腺癌淋巴結轉移組中的相對表達量明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.05)；STAT3 mRNA在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌組織中相對表達量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；STAT3 mRNA表達與維吾爾族乳腺癌淋巴結轉移狀況、臨床分期有關，而與組織學分級、直徑無顯著相關性(P>0.05)。MMP-2 mRNA在乳腺癌淋巴結轉移組中的相對表達量也明顯高于無淋巴結轉移組(P<0.05)；MMP-2 mRNA的相對表達量在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。見表5。

表5 維吾爾族乳腺癌組織STAT3和MMP-2 mRNA表達與臨床病理特征的關系

2.6 STAT3和MMP-2 mRNA表達與乳腺癌患者預后的關系 所有患者隨訪5年，生存63例，死亡15例，繪制維吾爾族乳腺癌患者術后1～60個月STAT3和MMP-2高、低表達者的生存曲線，STAT3高表達者及低表達者術后的總生存率分別為73.48%(36/49)、93.10%(27/29)，MMP-2高表達者及低表達者術后的總生存率分別為71.43%(35/49)、96.55%(28/29)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 不同STAT3表達水平維吾爾族乳腺癌患者5年生存曲線

3 討論

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤，也是全世界婦女癌癥相關死亡的主要原因[7]，尤其是新疆維吾爾族患者，復發和轉移的數量非常高，因此，尋找新的乳腺癌預后標志物和治療靶點具有重要意義。

眾所周知，Janus激活的激酶信號轉導和轉錄激活因子(JAK-STAT)信號通路在許多惡性腫瘤中起關鍵作用，JAK/STAT信號通路的表達水平與肺腺癌、結直腸癌[8]和食管鱗癌患者的淋巴結轉移和OS有關[9]。STAT3是JAK-STAT3信號通路的關鍵調節因子。STAT3是STATs家族的重要成員之一，因其與腫瘤的關系最為密切而成為目前研究的熱點，是多種惡性腫瘤的致癌基因[10]。在許多腫瘤中，激活的STAT3參與了細胞增殖、促進血管生成、侵襲、免疫抑制和抗凋亡[11]，然而，維吾爾族乳腺癌與JAK2/STAT3通路的關系仍不清楚。

圖3 不同MMP-2表達水平維吾爾族乳腺癌患者5年生存曲線

Sapio等[12]研究顯示STAT3在乳腺癌組織中異常高表達，對腫瘤的發生發展起著重要作用。Liu等[13]研究發現STAT3在乳腺癌組織中的表達與腫瘤臨床分期和侵襲轉移密切相關。從本研究結果顯示，STAT3蛋白和mRNA在維吾爾族乳腺癌中的陽性表達明顯高于正常乳腺組織，且STAT3蛋白的表達水平與腫瘤體積大小、組織學分級、淋巴結轉移、臨床分期均明顯相關，在腫瘤較大、發生淋巴結轉移、組織學分級較高、臨床分期較晚的維吾爾族浸潤性乳腺癌患者中STAT3蛋白的陽性表達率明顯升高，STAT3 mRNA的相對表達量與維吾爾族乳腺癌淋巴結轉移狀況、臨床分期有關，提示在維吾爾族乳腺癌患者中，STAT3表達水平越高腫瘤的增殖速度越快，侵襲性越強，易發生轉移，TNM分期越晚，預后越差，STAT3可能參與調控維吾爾族非特殊類型浸潤性乳腺癌的發生和發展，STAT3過表達是影響維吾爾族乳腺癌患者預后的獨立因素。目前許多研究集中在 JAK1/2抑制劑對各種實體腫瘤的生長、增殖、凋亡、血管生成和轉移的治療效果，近年來發現了一些新的特異性STAT3抑制劑，也有報道稱，STAT3抑制劑在小鼠乳腺癌模型中具有抗癌和免疫刺激作用[14]，靶向STAT3的聯合治療可能是乳腺癌的最佳治療方案[15]。

研究發現STAT3還可以介導IL-6誘導的MMP-2的表達以及乳腺癌細胞的遷移。Ma等[16]報道抑制STAT3磷酸化可以減少MMP-2在乳腺癌中的表達，本研究結果也顯示STAT3和MMP-2蛋白的表達具有明顯的相關性(P<0.05)。MMP可降解Ⅳ型膠原，促進基底膜破裂，MMP-2與腫瘤的侵襲和轉移過程以及腫瘤細胞的高侵襲能力有關[17]。據報道活化的MMP-2能增強腫瘤細胞穿透基底膜基質的能力，可促進多種腫瘤包括胰腺癌、肝細胞癌和肺癌等的轉移[18]。MMP-2表達的上調與乳腺癌患者的預后不良相關[19]。本研究結果顯示MMP-2蛋白和mRNA在維吾爾族乳腺癌中的陽性表達明顯高于正常組織；MMP-2的陽性表達率與維吾爾族乳腺癌腫瘤大小、組織分級、淋巴結轉移、臨床分期相關(P<0.05)，MMP-2蛋白在腫瘤體積較大、組織學分級較高、發生淋巴結轉移、TNM分期高的維吾爾族乳腺癌組織中的表達量明顯高于腫瘤體積較小、組織學分級較低、無淋巴結轉移組和TNM分期較低的乳腺癌，MMP-2 mRNA的表達與乳腺癌淋巴結轉移和腫瘤分期有關，MMP-2表達增高提示乳腺癌的增殖速度較快，侵襲性較強，易轉移，TNM分期較晚，預后欠佳。

綜上所述，STAT3和MMP-2與乳腺癌的臨床病理特征有關，兩者過度表達與預后不良有密切關系，提示STAT3和MMP-2可能參與維吾爾族乳腺癌的發生發展過程，STAT3和MMP-2高表達在乳腺癌的細胞分化、浸潤轉移中發揮重要的作用，本研究可能為研究乳腺癌發生機制和治療靶點提供理論依據。