缺氧誘導因子-1α去蘇素化修飾在特發性肺纖維化中的臨床意義*

王濤,宋曉萍,孫瑩,白利芳,肖祖琳,孫偉△

1大連大學附屬中山醫院呼吸一科(遼寧大連 116011)；2內蒙古自治區人民醫院呼吸與危重癥科(內蒙古呼和浩特 010017)

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是慢性進展性疾病，診斷后的生存時間不足3.5年[1]。目前雖有尼達尼布、吡非尼酮藥物用于治療IPF，但病死率無明顯降低[2]。因此，解析IPF進展的發病機制、尋求新的藥物靶點是我國對IPF防治的迫切需求和面臨的巨大挑戰。目前關于IPF的發病機制不清。新近研究發現，缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor，HIF-1α)是組織細胞對缺氧感應和調控的一類關鍵轉錄因子，低氧狀態下HIF-1α通過調節轉化生長因子-β1(TGF-β1)、白細胞介素-17(IL-17)、結締組織生長因子(CTGF)等多種致器官纖維化細胞因子的靶基因參與了IPF的整個進程[3-6]。已有的研究也表明，HIF-1α存在蘇素化修飾(small ubiquitin-related modifier,SUMO)的精細化調節，SUMO-1 化是重要的蛋白質翻譯后手段且是一個動態平衡的修飾過程[7-8]。常氧狀態下SUMO-1通過酶聯反應對HIF-1α進行水解，維持人體的正常生理功能，但在低氧狀態時可被特異性蛋白酶1(SENP1)催化的去SUMO修飾將其從靶蛋白上去除，使HIF-1α蛋白過表達[9-11]。所以本研究提出如下假設：在低氧條件下，SENP1催化的去SUMO化影響了SUMO化修飾對HIF-1α蛋白的降解，使其過度活化多種細胞因子，最終導致了IPF的進展。為驗證此假說，本研究檢測IPF患者血清中HIF-1α、SENP1的水平變化并分析兩者的相關性，進一步探討HIF-1α、SENP1在IPF中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2019年3月至2020年3月于我院臨床診斷為IPF的患者中，選取30例作為觀察組，另抽取同期健康體檢者30例作為對照組，所有受試者均知情并同意參加本研究。本研究經大連大學附屬中山醫院倫理委員會審核批準。兩組年齡、性別、吸煙史等差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標準 所有患者均為臨床診斷且符合 2011 年美國胸科學會/歐洲呼吸學會/日本呼吸學會/拉丁美洲胸科協會(ATS/ERS/JRS/ALAT)聯合發表的《特發性肺纖維化診治指南的診斷標準》。

排除標準：具有糖尿病等代謝性疾病者，合并嚴重肝腎疾病、惡性腫瘤者，近2個月內曾使用糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物治療者。

IPF急性加重(AEIPF)的判斷標準:(1)IPF患者近30 d內不明原因出現呼吸困難加重;(2)高分辨率CT(HRCT)在原有病變的基礎上出現新發雙肺磨玻璃影伴或不伴實變影;(3)氣管分泌物或肺泡灌洗液病原學檢查沒有感染依據;(4)除外左心力衰竭、肺栓塞、急性肺損傷等誘因。

根據該判定標準，IPF患者30例中，AEIPF患者為11例，穩定期患者為19例。

1.3 標本的分離與檢測 將采集到的所有受試者的外周血(8 mL)進行離心(3 000 r/min，10 min)以分離血清，然后將分離出的血清置于-80℃冰箱中保存備用。血清HIF-1α、SENP1水平的檢測使用酶聯免疫吸附試驗法，試劑盒均購自武漢基因美生物科技有限公司，按說明書進行操作。

1.4 肺功能檢查 肺通氣功能和彌散功能采用德國耶格 Master Screen Diffusion 型肺功能儀進行測定，測定指標為用力肺活量占預計值的百分比(FVC% pred)及一氧化碳彌散量占預計值的百分比 (DLco% pred)。

2 結果

2.1 兩組肺功能指標比較 觀察組患者肺功能指標(FVC% pred、DLco% pred)均顯著低于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組肺功能指標比較

2.2 兩組血清HIF-1α、SENP1水平比較 觀察組中血清HIF-1α、SENP1水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表 3。

表3 兩組血清HIF-1α、SENP1蛋白表達水平比較

2.3 觀察組血清HIF-1α與SENP1表達水平的相關性 觀察組血清HIF-1α水平與 SENP1水平呈線性相關，血清HIF-1α水平隨SENP1水平升高而升高，兩者呈顯著正相關(r=0.970，P=0.001)。見圖1。

圖1 IPF患者血清HIF-1α與SENP1的相關性

2.4 觀察組血清HIF-1α與SENP1表達水平與肺功能指標的相關性 血清HIF-1α水平與FVC% pred(r=-0.878，P=0.001)、DLco% (r=-0.940，P=0.001)均呈顯著負相關，血清SENP1水平與FVC% pred(r=-0.888，P=0.001)、DLco% (r=-0.953，P=0.001)呈顯著負相關。見圖2。

圖2 IPF患者血清HIF-1α、SENP1與肺功能的相關性

2.5 穩定期和AEIPF患者血清中HIF-1α與SENP1表達水平比較 HIF-1α與SENP1在AEIPF組中的表達水平較IPF組中的表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 HIF-1α、SENP1在穩定期和急性加重期患者血清中表達水平比較

3 討論

迄今，IPF發病機制尚不明確，臨床診斷時患者往往已處于疾病晚期，因缺乏有效的治療藥物，近年來IPF的病死率并無明顯緩解[12]。因此，深入解析其分子機制對尋找早期無創性血清標志物及尋求新的治療靶點可提供有力的臨床幫助。

HIF-1α是細胞適應低氧微環境的關鍵因子[13]。在常氧條件下，HIF-1α可被快速降解，以至于難以檢測到HIF-1α的表達；在低氧條件下，HIF-1α可調控促紅細胞生成素(EPO)、內皮素1(ET-1)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP-2及TGF-β1等多種靶基因的表達參與IPF進程[14-17]。所以，本研究認為HIF-1α可作為早期診斷IPF的生物標志物，以此為靶點可能是未來治療IPF的新策略。已有的研究表明，HIF-1α存在SUMO化修飾，SUMU化修飾是十分重要的泛素化修飾，通過非氧依賴的方式，介導了HIF-1α的水解抑制其表達，而低氧狀態下HIF-1α中的SUMU化修飾可被SENP1酶進行去泛素化，使SUMO化無法對HIF-1α進行降解[7,18-19]。因此本研究認為，SENP1催化的SUMO化修飾在IPF進展中扮演重要角色，以此為靶點可能改善HIF-1α對IPF的影響。為驗證這一學術觀點，首先基于臨床樣本觀察到了在IPF患者血清中HIF-1α蛋白表達水平明顯高于正常組，而SENP1表達水平也明顯高于對照組，同時應用簡單線性回歸分析發現IPF患者血清HIF-1α水平隨SENP1水平的升高而升高，Spearman 秩相關分析示兩者呈顯著正相關。這說明在IPF中SENP1抑制了SUMO化修飾對HIF-1α蛋白的水解，從而導致IPF患者血清中HIF-1α蛋白表達升高。這一實驗結果為下述觀察HIF-1α、SENP1是否與IPF病情相關奠定了理論基礎。

IPF患者的主要表現是限制性肺通氣功能障礙和彌散功能障礙，肺功能檢測可以直接反映IPF患者的病情變化，也能間接反映其病理損傷程度[20]。但部分老年患者無法配合完成肺功能檢查[21]。本研究結果顯示，IPF患者血清 HIF-1α、SENP1水平與FVC% pred、DLco% pred 呈顯著負相關，提示當肺功能檢測難以進行時，可以依據HIF-1α、SENP1蛋白的表達水平對患者病情進行評估。

AEIPF的發生是IPF病情進展及死亡的主要事件[22]。AEIPF發生時，氧分壓及細胞內的氧濃度明顯下降，此時HIF-1α發生了精細化的調節，即SENP1催化的去SUMO化修飾占據主導，SUMO化修飾受到抑制，導致了HIF-1α大量產生，最終導致了IPF疾病的進展[23]。在本研究中發現AEIPF患者，HIF-1α、SENP1表達水平較穩定期患者明顯升高。這一實驗結果與基礎研究的理論報道是一致的，也提示了SENP1催化的去SUMO化修飾影響了IPF的進展且與HIF-1α明顯相關。

目前盡管具體機制未明，生物標志物檢測有助于評估IPF患者的嚴重程度。同時IPF新藥的臨床試驗也迫切需要可靠的生物指標來進行療效評估。因此，有關生物標志物的研究日益得到重視。本研究雖然驗證了SENP1抑制HIF-1α的SUMU化修飾與IPF臨床特征有明顯的相關性，但抑制SENP1表達后能否通過增加SUMO修飾而抑制HIF-1α的表達等機制方面的問題仍需進一步闡明。