三氯醋酸對尖銳濕疣患者的治療效果及對Foxp3、CD34水平的影響

翟偉,林文,卞坤鵬,翟翊然,田卓

1南陽市中心醫院皮膚科(河南南陽 473000);2上海市(復旦大學附屬)公共衛生臨床中心感染科(上海 201058)

尖銳濕疣屬于一種由乳頭瘤病毒感染所導致的性傳播疾病，位于肛門生殖器皮膚及皮膚黏膜處，具有復發率高、傳染性強的特點，目前臨床研究發現，尖銳濕疣的復發和頑固難治與患者免疫功能低下相關[1]。目前臨床上治療尖銳濕疣的方法較多，包括化學治療、冷凍療法、激光治療、電灼治療、光動力學療法、手術治療以及免疫療法等，且臨床上對于不同種的治療方法效果評價不一[2]。三氯醋酸屬于一種化學腐蝕劑，將其涂抹于患者病變部位，通過促進疣體蛋白萎縮而到達治療的目的，且在對患者治療過程中不會被皮膚黏膜所吸收，安全性較高[3]。在本文研究中分析三氯醋酸治療尖銳濕疣的效果，為臨床上此病的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月至2018年12月我院收治的100例尖銳濕疣患者，按照完全隨機法隨機分為常規治療組和三氯醋酸組各50例。常規治療組男26例，女24例，年齡25～70歲，平均(47.5±1.5)歲，病程7 d～8個月，平均(4.5±0.5)個月，皮損數目(6.2±0.3)個，皮損直徑(5.1±0.5)mm。三氯醋酸組男25例，女25例，年齡25～68歲，平均(47.2±1.4)歲，病程8 d～8個月，平均(4.2±0.4)個月，皮損數目(6.5±0.9)個，皮損直徑(5.2±0.8)mm。兩組患者在上述一般資料中比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究所有患者及其家屬均知情，均簽署了知情同意書。

納入標準：所有患者均符合《尖銳濕疣診斷標準及處理原則》中對尖銳濕疣的診斷標準，疣體主要呈現為菜花狀、乳頭狀，且醋酸白試驗結果呈現為陽性。

排除標準：患有免疫缺陷性或者自身免疫性疾病者；合并其他性病的患者；對本次研究藥物過敏者；心肺功能不全者；溝通障礙、精神障礙者；合并腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組患者均行常規激光治療，取患者膀胱截石位，行常規病變處消毒，使用2%的利多卡因局麻，采用SPLB-200A型脈沖激光治療機治療，輸出功率：0.5～30.0 W，波長：10.6 μm，采用切割或者點灼消滅疣體，直達疣體基底部，并向外切割或者點灼超出疣體邊緣1～2 mm，每周1次，連續4周。常規治療組患者采用重組人干擾素α-2b治療，將其涂抹于患者病變部位及病變部位周圍，均勻涂抹，并按摩病變部位2 min，促進藥物吸收，2～3次/d，連續4周。三氯醋酸組患者采用三氯醋酸聯合重組人干擾素α-2b治療，首先對病變處進行常規消毒，使用醫用棉簽蘸取50%的三氯醋酸，均勻涂抹于患者病變部位，使用量以點遍患者病變部位為準，對于病變部位較大的患者可在一處行多次點涂，并在此過程中避免涂及患者正常皮膚處，之后其干燥后涂抹重組人干擾素α-2b。三氯醋酸2次/d，連續治療3 d，之后觀察3 d，若仍存在疣體重復治療，重組人干擾素α-2b用法用量同常規治療組。兩組患者在治療和復查期間均禁止性生活，預防再次感染，影響效果。

1.2.2 治愈時間、疼痛評價 統計兩組患者徹底治愈時間，采用目測類比定級法(VAS)評價疼痛情況，患者通過畫線(10 cm的直線)來表示疼痛程度，兩端分別代表無痛、劇痛，總分為10分，畫線越長說明分數越高表示患者疼痛感較重。

1.2.3 外周血Treg/Th17細胞平衡及Foxp3、RORγt表達檢測 采用流式細胞術檢測患者治療前后Treg/Th17細胞平衡情況，采用熒光定量RT-PCR檢測患者外周血單個核細胞中Foxp3、RORγt的表達，外周血單個核細胞采用淋巴細胞分離液分離，Trizol法提取總RNA，之后對RNA純度、含量進行檢測，使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得cDNA，之后使用Primer 5.0軟件對引物序列進行設計，使用RT-PCR方法檢測Foxp3、RORγt mRNA表達量，采用2-ΔΔCt方法計算出需要檢測的Foxp3、RORγt mRNA表達量。Foxp3引物序列：F：5′-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3′，R：5′-TCTCTCTGCCTCAGCCTTGCC-3′；RORγt引物序列：F：5′-CTGCTGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3′，R：5′-AGGAGTAGGCCGCGTTACAGC-3′；內參基因GAPDH引物序列：F：5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3′，R：5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

1.2.4 MCP-1、Hp、CD1a+-LC計數、CD34、VEGF表達檢測 取兩組患者治療前后疣體組織，在10%中性甲醛中固定，固定處理24 h后行常規的石蠟包埋處理，制作組織切片，厚度為4 μm。之后行常規切片脫蠟，將過氧化物酶阻斷液滴于每張切片中，在室溫下進行孵育，孵育10 min，行組織抗原微波修復或者胰酶消化，并滴加非免疫性動物血清，在室溫下進行孵育，孵育5 min，滴加一抗，在濕盒中37℃進行孵育，孵育60 min，滴加生物素所標記的二抗，在室溫下進行孵育，孵育10 min，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶溶液，再次在室溫下進行孵育，孵育10 min。上述各步驟均采用PBS反復清洗3次，食用DAB顯色，細胞核使用蘇木素復染，采用中性樹脂封片處理。陽性對照為已知陽性片，陰性對照為PBS代替一抗。MCP-1、Hp表達判定：采用Motic彩色醫學圖文分析系統分析，將顯色反應根據白-黑分為0～255個等級，1個陽性單位(PU值)為1個等級，隨機選取每個標本中10個視野，讀取PU值，取10個視野PU值的平均值。CD1a+-LC計數：細胞膜或者細胞核呈現為黃褐色樹枝狀圖突起的細胞，取5個朗格漢斯細胞分布最為密集的區域，行CD1a+-LC計數，取平均值。微血管密度計數(CD34陽性血管計數)：CD34陽性細胞為細胞核或者細胞漿出現棕褐色或者淡至棕黃色的顆粒，依次在低倍鏡下尋找高血管密度區，在高倍鏡下對所著色的微小血管和毛細血管進行計數，計算5個高倍視野下血管數量的平均數。VEGF：采用半定量積分法表示，陽性顯色為淺黃至棕褐色顆粒，細胞質著色占主要部分。根據染色程度和染色細胞百分比進行評分：不著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；著色細胞數≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，≥51% 3分。陰性(-)得分≤1分，弱陽性(+)得分2～3分；中度陽性(++)得分4～5分；強陽性(+++)得分≥6分。每份標本在鏡頭下隨機選擇5個視野，取其平均值。

1.2.5 治療效果、復發率評價 參照《尖銳濕疣診療指南(2014)》標準對患者治療效果進行評價，分為痊愈、顯效、有效、無效4個評價等級。其中痊愈：疣體全部消失，無皮損；顯效：疣體全部消失，皮損面積減少60.0%～99.0%；有效:疣體全部消失，皮損面積減少20.0%～59.0%；無效：疣體未消失，皮損面積減少<19.0%。治療總有效率=痊愈率+顯效率。對患者行為期半年的隨訪，統計復發率，復發：患者在原皮損部位或者皮損相鄰的復位發現新生疣體，且醋酸白試驗結果呈現為陽性。

1.2.6 不良反應統計 統計輕度淺表潰瘍、紅腫疼痛、刺痛感、灼燒感等不良反應發生情況，并作組間比較。

2 結果

2.1 兩組患者徹底治愈時間、疼痛情況比較 三氯醋酸組患者徹底治愈時間、疼痛評分均低于常規治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者徹底治愈時間、疼痛情況比較

2.2 兩組患者外周血Treg/Th17細胞平衡及Foxp3、RORγt表達比較 兩組患者治療前Treg、Th17、Treg/Th17、Foxp3、RORγt表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)；兩組患者治療后Treg、Th17、Treg/Th17、Foxp3、RORγt表達均低于治療前，且三氯醋酸組患者治療后Treg、Th17、Treg/Th17、Foxp3、RORγt表達均低于常規治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者外周血Treg/Th17細胞平衡及Foxp3、RORγt表達比較

2.3 兩組患者尖銳濕疣組織中MCP-1、Hp、CD1a+-LC計數比較 兩組患者治療前MCP-1、Hp、CD1a+-LC計數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；兩組患者治療后MCP-1、CD1a+-LC計數高于治療前，Hp低于治療前，且三氯醋酸組患者治療后MCP-1、CD1a+-LC計數高于常規治療組，Hp低于常規治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者尖銳濕疣組織中MCP-1、Hp、CD1a+-LC計數比較

2.4 兩組患者尖銳濕疣組織中CD34、VEGF表達情況比較 兩組患者治療前CD34、VEGF表達情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)；兩組患者治療后CD34、VEGF表達均低于治療前，且三氯醋酸組患者治療后CD34、VEGF表達均低于常規治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4和圖1～2。

表4 兩組患者尖銳濕疣組織中CD34、VEGF表達情況比較

注：A：治療前；B：治療后圖1 患者治療前后CD34在尖銳濕疣組織中的表達(免疫組化，×200)

注：A：治療前；B：治療后圖2 患者治療前后VEGF在尖銳濕疣組織中的表達(免疫組化，×200)

2.5 兩組患者治療效果、復發率比較 三氯醋酸組治療總有效率高于常規治療組，復發率低于常規治療組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 兩組患者治療效果、復發率比較 例(%)

2.6 兩組患者不良反應發生情況比較 三氯醋酸組總不良反應發生率高于常規治療組，但兩組比較差異無統計學意義(2=0.154，P=0.695)。見表6。

表6 兩組患者不良反應發生情況比較 例(%)

3 討論

尖銳濕疣屬于一種常見的性傳播疾病，目前臨床上認為[4]，尖銳濕疣的主要治療原則為去除疣體并且預防復發，且常用方法包括光動力療法、冷凍治療、微波、高頻電刀、藥物治療等。

三氯醋酸屬于一種化學腐蝕劑，會對皮膚黏膜產生腐蝕作用，但其對皮膚黏膜的腐蝕力較弱，可到達至上皮層[5]。有研究表明[6]，三氯醋酸可強效溶解角質蛋白，目前已經應用于低級別陰道上皮內瘤變的治療中，治療效果較為理想，且安全性較高。研究認為[7]，尖銳濕疣為上皮層病變，因此臨床上認為常規的三氯醋酸治療效果并不理想，因此在本研究中應用50%的三氯醋酸對患者進行治療，以增強其腐蝕作用，結果顯示，在患者運用重組人干擾素α-2b治療前應用50%的三氯醋酸，可顯著改善患者臨床癥狀，促進恢復，此結果提示著，運用重組人干擾素α-2b治療前應用50%的三氯醋酸可二次殺滅患者病損處細菌，抑制病毒蔓延，降低HPV感染的風險，以提高機體抗病毒能力，起到治療的目的。

尖銳濕疣患者均存在不同程度的免疫失衡，影響機體對HPV的清除，導致疾病反復。Treg細胞為CD4+T細胞的新亞群，具有調控機體免疫應答、維持機體免疫自穩等作用，在多數病毒感染性疾病中Treg細胞具有重要的平衡作用，可抑制過度免疫反應所引起的組織損傷和保護某些病原體感染時的保護性免疫反應，影響宿主清除病原體[8]。Th17細胞為CD4+T細胞的新亞群，主要分泌炎性細胞因子，可介導炎癥反應，在腫瘤發生發展、自身免疫性疾病、感染性疾病中具有重要的作用[9]。Foxp3屬一種Tregs的特異性分子標記物，在Treg細胞功能抑制和生長發育中具有重要的意義[10-11]。RORγt屬Th17細胞特異性轉錄因子，屬維甲酸相關孤兒核受體家族成員，可誘導Th17細胞生成[12-13]。本研究結果顯示，患者在患病后均存在Treg/Th17細胞失衡和Foxp3、RORγt的異常表達，治療后患者Treg/Th17細胞失衡和Foxp3、RORγt的異常表達均得到改善，但聯合應用三氯醋酸的患者改善效果更為明顯，此結果說明，三氯醋酸協同重組人干擾素α-2b共同發揮其藥物作用，通過改善Treg/Th17細胞失衡和Foxp3、RORγt的異常表達，改善機體細胞免疫。朗格罕斯細胞屬于皮膚與生殖器黏膜臨床上皮中的專職抗原呈遞細胞，可激發局部特異性細胞免疫和刺激T細胞，在機體免疫監視中具有重要的作用[14]。研究認為[15]，當MCP-1表達降低后可抑制趨化因子所介導的朗格漢斯細胞、朗格漢斯細胞前體細胞在疣體病變組織的募集，使得免疫細胞活化力下降，使得機體降低對HPV的應答，最后引發HPV病毒免疫逃逸，導致疾病難愈合和易反復的發生。Hp屬急性期蛋白，可促進血管生成、免疫調節和抗感染，研究認為[16]，當Hp高表達后會抑制朗格漢斯細胞免疫功能成熟。本研究顯示，治療后患者MCP-1、Hp異常表達均得到改善，但聯合應用三氯醋酸的患者改善效果更為明顯，此結果說明，三氯醋酸可能通過改善MCP-1、Hp異常表達，促進朗格漢斯細胞免疫功能成熟，增強機體免疫力，抵抗病毒。

尖銳濕疣疣體組織的生長需營養物質供給和氧氣，疣體組織所產生的調節機制與促進新生血管生成有關，且其周圍存在較多較為豐富的血流供應，以促進疣體生長[17-18]。VEGF為血管生成因子，與血管生成相關，研究認為[19]，尖銳濕疣患者疣體組織中VEGF表達顯著升高。目前臨床上多應用微血管密度計數進行評價血管形成強度和能力，而CD34為一種血管內皮細胞標記物，其抗原特異性較高，且其敏感性高、重復性好的特點[20]。在本研究中運用CD34對微血管進行標記，測定微血管密度計數，并檢測疣體組織中VEGF水平，結果顯示，治療后患者VEGF、CD34異常表達均得到改善，但聯合應用三氯醋酸的患者改善效果更為明顯，此結果說明，三氯醋酸可能通過改善VEGF、CD34異常表達，抑制疣體組織血管生成，進而使得疣體萎縮，達到治療的目的。

本研究中將三氯醋酸應用于尖銳濕疣的治療中，發現尖銳濕疣患者使用三氯醋酸治療有效，可顯著改善臨床癥狀，但因本研究樣本量較少，數據統計可能存在一定的偏倚，另外目前臨床上對于三氯醋酸在尖銳濕疣中研究較少，因此本研究結果還需后續研究進一步證實，以期望為此病的臨床治療提供新方向，促進患者恢復。

綜上所述，尖銳濕疣患者使用三氯醋酸治療，可顯著改善機體免疫功能，維持Treg/Th17細胞平衡，改善Foxp3、CD34異常表達，改善臨床癥狀，效果顯著。