膿毒性心肌病患者血漿microRNA表達譜差異的初步研究

洪澄英， 陳懷生， 陳友蓮， 劉曉君， 劉雪燕

（深圳市人民醫院重癥醫學科，暨南大學附屬第二臨床醫院，廣東深圳518020）

膿毒癥定義為由宿主對感染的反應失調引起的威脅生命的器官功能障礙［1］，嚴重威脅人類健康。研究顯示，在膿毒癥患者中，約60%可存在膿毒性心肌病［2］，其中約20%為重度心力衰竭，當左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）≤0.40 時，其病死率可達70%［3］。而早期識別膿毒性心肌病，盡早給予相應治療，是降低膿毒癥患者死亡率的關鍵之一。臨床上心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）等生物標志物是檢測早期心肌損傷的重要標志物［4］，但這些生物標志物可能在重癥患者中顯示出局限性，尤其是合并基礎心臟病如冠心病的患者，其升高往往受多種因素影響，并不能作為膿毒性心肌病的早期診斷依據。血漿微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小分子單鏈非編碼RNA，研究提示某些miRNA 可能在膿毒癥導致的心功能障礙患者中表達異常，具有潛在作用［5-7］，但關于膿毒癥心肌病miRNA 的研究目前仍較少，本研究通過檢測血漿miRNA 表達水平，分別對比其在健康人，膿毒癥心功能正常患者及膿毒性心肌病患者外周血中的表達情況，篩選出在膿毒癥導致心功能不全患者外周血中異常表達的miRNA 并進行分析，以期尋找早期診斷膿毒性心肌病的生物標志物。

材料和方法

1 研究對象

本研究經深圳市人民醫院倫理委員會審議同意（編號LL-KY-2019507），根據納入標準及排除標準隨機納入 2019 年 1 月～2019 年 12 月入住深圳市人民醫院重癥醫學科的患者14 例，根據心功能情況分為膿毒癥心功能正常組（8 例）和膿毒性心肌病組（6 例），同時招募健康志愿者6例作為健康對照（healthy control）組。患者及健康志愿者簽署知情同意書。

膿毒癥診斷標準：符合第三版膿毒癥和膿毒癥休克定義的國際共識［1］，明確存在感染的患者，SOFA評分急性改變≥2分。

膿毒性心肌病組納入標準：年齡＞18 周歲，符合膿毒癥診斷標準，膿毒性心肌病目前尚無統一標準，本研究采用膿毒癥患者LVEF 下降（LVEF＜0.5）作為診斷標準［8］。

排除標準：年齡＜18 周歲；24 h 內可能出院或死亡的患者；合并冠心病或急性心肌梗死患者；存在心腦血管基礎疾病患者；存在風濕免疫疾病患者；存在嚴重神經系統疾病患者；存在血液系統疾病患者；孕產婦；晚期腫瘤患者；存在慢性肝病患者。

2 一般資料

根據患者的LVEF 情況，14 例患者分為心功能正常組（8 例）及膿毒性心肌病組（6 例），兩組患者年齡，SOFA 評分，APEACHEII 評分對比無統計學差異（P＞0.05），具體詳見表1。

表1 兩組患者入組時的一般資料Table 1.General data of patients in both groups at the time of enrolment（Mean±SD）

3 實驗方法

所有患者根據納入標準納入研究24 h 內取靜脈血送本院檢驗科查cTnI 和CK-MB，同時取靜脈血3 mL，貯存于全血RNA 靜脈真空采血管（BD 762165 PAXgen）。NanoDropTMOne/OneC 檢測 RNA 純度，Life Invitrogen Qubit?3.0 熒 光 定 量 儀 采 用 QubitTMRNA HS Assay Kit精確定量測量RNA；Agilent 4200 TapeS-tation 系統精確檢測RNA 的完整性。利用small RNA的3‘端及5’端完整磷酸基團結構，分別在兩端連接接頭，逆轉錄合成 cDNA，進行 PCR 擴增，PAGE 膠電泳分離純化目標DNA片段，獲得特定大小small RNA文庫。質量檢測后，進行測序。參考基因組比對，進行miRNA 分析，miRNA 表達和差異分析，取FDR＜0.05的高表達miRNA。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0進行統計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 生物標志物情況對比

膿毒性心肌病組與膿毒癥心功能正常組兩組患者cTnI 和CK-MB 對比，差異無統計學差異（P＜0.05），而膿毒性心肌病組LVEF 較膿毒癥心功能正常組顯著下降（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者生物標志物及LVEF對比Table 2.Comparison of biomarkers and LVEF between the two groups（Mean±SD）

2 芯片檢測結果

獲得特定大小small RNA 文庫，質量檢測后，進行測序。參考基因組比對，進行miRNA 分析，miRNA 表達和差異分析，取FDR 小于0.05 的高表達miRNA。應用Cluster 3.0聚類分析，結果見圖1、2。

Figure 1.The cluster analysis diagram of healthy control group（n=6）and septic cardiomyopathy group（n=6）.圖1 健康對照組及膿毒性心肌病組聚類分析圖

Figure 2.The cluster analysis diagram of healthy control group（n=6）and normal heart function with sepsis group（n=8）.圖2 健康對照組及膿毒癥心功能正常組聚類分析圖

3 血漿miRNAs的表達情況

與健康對照組相比，膿毒癥心功能正常組有105種miRNAs 表達上調，而膿毒性心肌病組有45 種miRNAs 表達上調，兩組中表達明顯上調的20 種miRNAs 列表分別見表3、4。其中，膿毒癥心功能正常組及膿毒性心肌病組miR-122-5p表達上調均顯著高于其他的miRNA，見圖3、4。

表3 與健康對照組對比，膿毒癥心功能正常組表達上調的miRNAs前20種列表Table 3.The top 20 miRNAs up-regulated in normal heart function with sepsis group compared with healthy control group

表4 與健康對照組對比，膿毒性心肌病組表達上調的miRNAs前20種列表Table 4.The top 20 miRNAs up-regulated in septic cardiomyopathy group compared with healthy control group

Figure 3.The volcano plot of septic cardiomyopathy group（n=6）. Padj：adjusted P value；FC：fold change.圖3 膿毒性心肌病組火山圖

Figure 4.The volcano plot of normal heart function with sepsis group（n=8）. Padj：adjusted P value；FC：fold change.圖4 膿毒癥心功能正常組火山圖

3 同一miRNA 在膿毒癥心功能正常組與膿毒性心肌病組外周血漿中表達情況的對比

與健康對照組相比較，同一miRNA 在兩組中均表達上調，且膿毒性心肌病組較膿毒癥心功能正常組表達顯著升高的5 種miRNAs 分別為miR-122-5p，miR-122b-5p，miR-122-3p，miR-122b-3p 和 miR-885-5p，其中，與健康對照比較，在膿毒性心肌病患者中的miR-122-5p表達升高的倍數是膿毒癥心功能正常組患者的兩倍以上，見圖5。

Figure 5.The5miRNAs that were significantly up-regulated in septic cardiomyopathy group compared with septic normal heart function with sepsis group.圖5 膿毒性心肌病組較膿毒癥心功能正常組表達顯著升高的5種miRNAs

討 論

膿毒癥尤其是膿毒性休克時，潛在的炎癥過程通常伴有血液動力學障礙，從而導致組織灌注減少和細胞供氧減少，加劇了終末器官損害，而器官衰竭，尤其是心功能障礙是膿毒癥導致死亡的主要原因［9］。心肌收縮力受損，射血分數降低，舒張期順應性下降等是膿毒性心肌病的主要表現，其確切的病理生理過程目前仍不明確，亦沒有特效藥物能夠給予預防［10］，目前仍缺乏早期診斷膿毒性心肌病的有效生物學指標。

某些miRNA 在健康的心臟組織中高度表達，可能在維持正常心臟功能中起作用（如miR-1，miR-16，miR-27b，miR-30d，miR-126，miR-133 和 miR-143等）［11］。由于膿毒癥導致的心功能障礙涉及到多種病理生理過程，可出現多種miRNA 表達水平失衡，多項研究提示異常表達的miRNA 在膿毒性心肌病發展中具有重要的調節作用，可以幫助診斷，判斷預后。近期的一項研究顯示內毒素（lipopolysaccharide，LPS）引起的膿毒癥休克大鼠心肌中有78 種miRNA 存在差異表達，其中miR-155-3p 增加了2.8倍，miR-155-5p 上調了 1.9 倍［12］，抑制 miR-155 可減輕LPS誘導的小鼠心功能障礙和細胞凋亡［6］，研究顯示，miR-155-5p 及miR-133-3p 在膿毒癥心肌損傷組患者血漿中表達顯著升高［13］，有助于早期診斷膿毒性心肌病。另外，目前體內及體外的研究證實其他的幾種miRNA 的表達失調，如 miR-146a，miR-125b，miR-21-3p和miR-23b等可以加重炎癥和膿毒癥誘導的心臟功能障礙［14］；膿毒癥患者血漿 miR-499 水平與LVEF 負相關，與血cTnI 水平正相關，可反映膿毒癥合并心肌損傷病情的嚴重程度［15］。

本研究通過對比觀察膿毒性心肌病患者、膿毒癥心功能正常患者與正常人群之間miRNAs 的差異表達譜，顯示與健康對照組相比，多種miRNA 在膿毒癥患者外周血漿中表達均顯著增高，但與上述國內外研究結果不同的是，膿毒性心肌病組較膿毒癥心功能正常組表達升高顯著的5 種miRNA 分別為miR-122-5p，miR-122b-5p，miR-122-3p，miR-122b-3p和 miR-885-5p，miR-122 尤其是 miR-122-5p，其升高的倍數是膿毒癥心功能正常患者的兩倍以上。而既往的研究顯示循環miR-122 是一種組織特異性RNA，幾乎占所有肝臟miRNA 的70%，在其他組織中的表達較少［16］，主要在肝癌術前及病毒性肝炎患者血清中升高［17］，其血清濃度的變化還與炎癥性疾病和膿毒癥引起的急性肝功能障礙有關［18-20］；與健康對照組相比，miR-122表達的改變可能被用作膿毒癥診斷的生物標志物［21］，Rahmel 等［22］的研究顯示升高的miR-122 血清濃度有助于區別普通感染和膿毒癥，是30 d 死亡的早期和獨立的危險因素，miR-122的表達與膿毒癥患者平均動脈壓和去甲腎上腺素劑量之間存在顯著相關性，但目前尚未見miR-122 尤其是miR-122-5p 在膿毒性心肌病中的報道。另外，我們研究顯示的另一個重要意義是，當傳統的臨床標志物如cTnI 及CK-MB 無顯著統計學差異時，miR-122 表達水平高低可能可以更早區分出膿毒癥患者被掩蓋的心功能下降，這些miRNA 有可能成為早期診斷膿毒性心肌病的生物標志物。

因此，相較于傳統的臨床標志物，miR-122 尤其miR-122-5p 在膿毒性心肌病患者血漿中表達顯著升高，可能成為早期診斷膿毒性心肌病的生物標志物，有助于早期診斷。但本研究仍存在局限性，首先，本研究旨在初步了解膿毒性心肌病患者血漿miRNAs有無存在異常表達，僅納入膿毒癥心功能正常患者8例及膿毒性心肌病患者6 例進行血漿miRNAs 分析，盡管基礎病方面已排除了大量具有合并相關疾病的患者，且兩組患者年齡、SOFA 評分，APEACHEII 評分對比無顯著差異，盡可能排除了基礎病、年齡、疾病嚴重程度、器官功能損害情況等對血漿miRNA 表達的影響，但兩組標本較少，未能將兩組患者的其它臨床資料與miRNA 進行多因素風險分析，同時未能對不同嚴重程度膿毒性心肌病患者進行分組研究，亦未能進一步進行ROC 曲線分析異常表達的miRNA 水平在膿毒性心肌病中的診斷價值；其次本研究未動態監測異常表達miRNA 的水平變化，未能進一步闡述其在患者病情發生發展中的動態改變。最后，異常表達的miRNA 參與膿毒癥心肌損傷的病理機制仍不清楚。我們的研究結果仍需要在具有大量隊列的前瞻性研究中得到驗證，在未來的研究中，我們將擴大樣本量，同時爭取從同一患者獲得多個時間點樣本來確定基因表達水平的動態改變，進一步明確異常表達的miRNA 與膿毒性心肌病發生發展的相關性及可能的致病機制。