二代測序技術在人工關節感染病原學診斷中的應用

蔣昊辰 宋春鳳 朱文潤 龐之楹 白 楊 曹 露 陳及非 郭常安

（復旦大學附屬中山醫院骨科 上海 200032）

人工關節置換術是治療終末期關節病的有效方法，人工關節感染（periprosthetic joint infection，PJI）是人工關節置換術后嚴重的并發癥［1-2］，會增加致殘風險和經濟負擔。PJI的治療難點在于早期及時診斷病原體［3］。常規病原培養是目前最常用的PJI病原體的檢測手段，因為取樣前使用抗生素、取樣及培養過程污染、培養條件不當、存在生物膜等情況，現有培養陰性率高達20%～40%，無法確診致病菌可能導致PJI治療失敗［4］。

宏基因組二代測序技術（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）是應用最為廣泛的二代測序技術。mNGS是運用生物信息分析技術檢測出樣本中所有微生物的種類及序列數量的方法，因其可以無偏倚檢測所有核酸，從而在不依賴病原學培養技術的前提下，能夠同時檢測細菌、真菌、病毒和寄生蟲。理論上mNGS可無偏倚、快速診斷PJI，尤其可解決培養陰性PJI的診斷難題。

目前國內應用mNGS診斷PJI尚處于起步階段，本研究通過傳統微生物培養方法和mNGS技術檢測PJI標本，比較兩者診斷效能，評估mNGS對PJI病原學診斷的臨床價值。

資料和方法

研究對象收集2017年1月—2019年12月在復旦大學附屬中山醫院行人工關節置換術后出現疑似PJI癥狀而住院的患者。根據2011版美國骨骼肌肉感染協會（Musculoskeletal Infection Society，MSIS）診斷標準［5］進行診斷（圖1）。納入標準：（1）臨床資料完善，可行MSIS診斷；（2）配合隨訪；（3）知情同意；（4）關節液與假體周圍組織均行病原培養與mNGS測序。排除標準：（1）因各種原因不能配合者；（2）取材過程中存在明確污染；（3）臨床取樣量不足；（4）資料不全無法進行MSIS診斷。

圖1 研究流程圖Fig 1 Research flowchart

取樣操作所有患者手術過程中均進行關節液和假體周圍組織取樣。

關節液取樣：術中切開關節囊前，用無菌針筒進行關節腔穿刺，抽取關節液，避免混入血液。取樣分為兩部分，一部分直接注射進需氧、厭氧、真菌和血培養瓶中，30 min內運送至我院檢驗科微生物室，另一部分裝入無脫氧核糖核酸酶的無菌凍存容器中，30 min內置于-80℃冰箱保存。

假體周圍組織取樣：翻修術中使用無菌手術刀在3處不同部位（存在炎癥的部位）切取假體周圍組織，避免混入液體。裝入無菌容器中，30 min內行傳統微生物培養；在微生物室無菌條件下，與3 mL腦心浸液肉湯混合研磨1 min，形成組織勻漿后進行培養，剩余組織勻漿裝入無脫氧核糖核酸酶的無菌凍存容器中，于-80℃冰箱保存。

病原體培養于我院檢驗科行病原體培養，分別于血瓊脂平板、巧克力平板、念珠菌顯色平板、沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板、分枝桿菌培養系統行細菌、真菌和分枝桿菌培養。應用鑒定藥敏系統和飛行時間質譜鑒定以確認病原體。

mNGS檢測與數據分析按照華大基因BGISEQ-100平臺標準測序流程進行測序。

提取核酸：室溫下解凍標本，取0.6 mL關節液/組織勻漿，混合1 g玻璃珠（半徑0.5 mm），在破壁管中以16 000×g高速離心10 min，取0.3 mL破壁產物，根據天根試劑盒步驟操作，提取核酸。取500 ng核酸，根據標準化操作指南行超聲，破碎至200～300 bp的片段。

高通量測序：架構文庫后進行測序，核酸濃度與插入片段的長度符合生物分析儀（Agilent 2100）質量控制庫的要求，環化處理后變成環形單鏈構造的文庫。對文庫進行滾環復制操作，產生DNA納米球。使用BGISEQ-100測序平臺對加載DNA納米球的測序芯片進行高通量測序。

數據處理：對測序平臺輸出的數據進行處理，排除35 bp以下和質量過低的數據，獲得高質量的測序數據。然后選擇Burrows-Wheeler Alignment（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）進行比對，與人源參考基因組一致的序列數據將被排除。最終合格的數據在刪除低復雜度數據后，使用美國國家生物信息中心數據庫（包括3 446種細菌、4 152種病毒、206種真菌和140種寄生蟲的微生物數據庫）與處理所得數據進行比對，從而獲得匹配病原體的序列數，根據序列數高低、覆蓋度、相對豐度等指標最終出具檢測報告。

mNGS陽性標準：細菌種水平覆蓋度10倍及以上；真菌、病毒種水平覆蓋度5倍及以上。

統計學方法通過SPSS 22.0軟件進行數據處理。連續性變量符合正態分布的用均值表示，不符合正態分布的用中位數表示；分類變量用n（%）表示。

結 果

一般資料共13例（髖關節4例，膝關節8例，肘關節1例）納入研究。根據MSIS診斷標準，13例均診斷為PJI。男8例，女5例，年齡18～81歲，初次置換后出現癥狀的中位時間為104（2～886）周，初次置換病因包括骨關節炎、外傷、骨腫瘤、類風濕性關節炎、股骨頭壞死。翻修術前血沉平均水平為（67.77±32.74）mm/h，C反應蛋白中位水平為77.60 mg/dL。

培養與mNGS檢測結果比較13例PJI患者中，mNGS陽性11例（84.62%），2例檢出多重感染（檢出病原數＞2）；培養陽性10例（76.92%）。兩者檢測結果相符6例（46.15%），mNGS陽性率較優于病原培養（表1）。膝關節中，mNGS陽性率75.00%，培養陽性率87.50%；髖關節中，mNGS陽性率100.00%，培養陽性率50.00%。9例患者在取樣前未停用抗生素2周，mNGS陽性率100%，培養陽性率66.67%。mNGS平均檢測時間48 h，平均培養時間7天。

表1 PJI病原學診斷中二代測序和培養結果比較Tab 1 Results of mNGS and culture in diagnosis of PJI

mNGS檢測結果關節液和假體周圍組織樣本中，mNGS檢出有效序列的中位數分別為78（5～1 520）和13（3～345）（表2）。

表2 關節液和假體周圍組織中mNGS檢測結果Tab 2 Results of mNGS in synovial fluid and periprosthetic tissues

培養陰性病例在3例培養陰性的病例中，mNGS均檢出有臨床意義的陽性病原體，包括1例人型支原體、1例金黃色葡萄球菌和1例屎腸球菌。術前均長期使用抗生素治療。

討 論

本研究發現mNGS可以從PJI病例的關節液和假體周圍組織中成功檢出致病病原體，mNGS病原檢出率84.62%，優于培養檢出率76.92 %，且與培養結果有良好的一致性，說明mNGS在高敏感性的同時有較高準確性，能檢出罕見菌，在培養陰性病例中檢出致病病原體，識別多重感染；因此，mNGS技術有助于PJI病原學診斷。

mNGS與培養檢測能力相當本研究中mNGS檢出病原體情況與文獻報道金黃色葡萄球菌是PJI最常見的致病病原體相符［6］。PJI致病病原體包括金黃色葡萄球菌、各類革蘭氏陰性桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌等，真菌和支原體導致的感染較為罕見。本研究利用mNGS和培養均檢出罕見病原體。通過mNGS檢測出1例人型支原體感染導致的PJI、1例白假絲酵母菌感染導致的PJI，以及2例少見病原體與常見病原體共同導致的混合多重感染，與文獻結果相符［7］。Huang等［8］報道使用mNGS技術成功診斷微小單胞菌（Parvimonas micra）導致的少見PJI。表明mNGS技術與病原培養檢測能力相當，且能夠在培養陰性PJI中檢測出罕見病原體。

mNGS的優勢

檢測速度快mNGS平均48 h取得結果，病原培養檢測平均耗時7天，考慮到有效治療PJI依賴于早期明確的病原學診斷以及相應針對性治療，mNGS高效的檢測速度在早期診斷方面具有顯著優 勢，Zhang等［9］研究表明在苛養菌檢測方面，mNGS的檢出陽性率和檢測速度均占優勢。

檢出率高在培養陰性病例中，成功治療PJI關鍵是早期明確致病病原體，使用敏感抗生素治療和及時清創翻修。現有診斷技術依賴培養結果，可能因出現假陰性而無法明確病原體。診斷“金標準”是傳統病原學培養，通過對關節液、假體周圍組織、超聲裂解液等臨床標本進行培養，陽性率為50%～70%［10］。相關研究中培養陰性PJI占10%～20%［11］。典型病例中，雖然發熱、竇道、傷口滲液、炎癥指標升高、影像學檢查和術中所見均提示存在PJI，但因為致病菌是罕見菌，培養陰性，及時清創手術和經驗性抗生素治療無法有效控制感染，mNGS檢測明確病原體后行針對性治療，成功控制感染，并且可以識別多重感染。文獻報道中17%～39%PJI為多重混合感染［12-13］，本研究中的多重感染檢出率為15.38%，聯合應用敏感抗生素成功控制感染。Tarabichi等［7］報告aNGS技術在培養陰性病例中的陽性率為81.8%，并可識別多重感染。相較于病原培養，mNGS識別出的病原體種類更多，陽性率更高，可以有效彌補傳統培養敏感性較低且無法識別多重感染的不足，有效提高治療成功率，且本研究后續隨訪病例均未出現感染復發。也有研究認為mNGS檢測的敏感性與培養沒有顯著差異［14］。

檢測樣本多樣mNGS通過對樣本中的核酸進行擴增后進行檢測，相比于微生物培養，mNGS對于送檢樣本量要求低，有研究提示在低容量的關節液中NGS檢測依然保持高敏感性和特異性，為臨床取樣增加靈活性及樣本來源［15］。Cai等［16］研究發現，mNGS技術在假體周圍組織的敏感性和特異性分別為95.45%和90.91%，均明顯優于病原培養；Huang等［17］研究發現，mNGS技術在關節液中的敏感性為95.9%，高于培養（79.6%）的敏感性。

受抗生素影響較小臨床上經驗性抗生素治療會降低培養的陽性率。理論上mNGS技術檢測病原體核酸，與病原體存活與否無關，不受抗生素影響，但實際上核酸的半衰期短，使用抗生素仍會使mNGS檢出率下降，本研究中采樣前使用抗生素的病例mNGS陽性率為100%，優于以往研究。

綜上，mNGS基本能夠彌補培養技術在臨床應用中的不足和缺陷，是一種可替代培養，甚至優于培養的病原學診斷技術手段。

mNGS技術不足與局限性（1）費用昂貴：樣本檢測費用遠高于培養。（2）軟硬件要求高：需要專業實驗室和技術人員，暫時無法普及至各級醫院。（3）存在污染、假陽性情況：出現假陽性的主要原因為采樣轉運檢測過程中的污染，如未在層流手術室進行采樣、采樣過程中混雜皮膚表面定植菌［18-19］（包括表皮葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌等）、轉運容器中存在微生物核酸、核酸提取試劑盒污染、檢測過程空氣中微生物的污染，以及在建庫時提取的DNA初始濃度低，導致多次擴增放大污染，從而造成假陽性［20］。（4）無法進行藥敏試驗：普通培養能夠同時進行藥敏試驗，指導臨床及時根據病原體耐藥情況調整抗菌藥物，mNGS僅能夠提示致病病原體，無法同步獲知藥敏情況，mNGS暫時無法完全取代傳統培養技術。

本研究的局限性（1）考慮到PJI的發病率，且mNGS是一門新興技術，本研究作為一項單中心的研究，納入的病例數較少，可能存在偏倚影響結論可靠性；（2）單個樣本的mNGS測序費用昂貴，無法檢測初次置換術中樣本是否存在病原體，評估mNGS的特異性；（3）無法保證所有樣本取樣醫師以及手術醫師均相同；（4）感染治療后短期隨訪，平均隨訪時間15.3個月，無法評估中長期感染復發情況。

本研究提示mNGS技術對PJI病原學診斷具有較大價值，能夠提高檢出率，檢測出培養難以鑒定的病原體，縮短檢測時間，是細菌培養的良好補充檢測方法。將來需要多中心、大樣本、多類型的mNGS診斷效能研究。

作者貢獻聲明蔣昊辰論文構思、撰寫和修訂，數據采集。宋春鳳，朱文潤，龐之楹，白楊，曹露，陳及非病例收集。郭常安論文構思、指導和修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。