不同emm基因型化膿性鏈球菌的菌落形態

歐陽霖王小光宋馳萍陳明亮張穎華△

（1上海市閔行區疾病預防控制中心微檢科 上海 201101；2復旦大學公共衛生學院閔行分院 上海 201101；3上海市疾病預防控制中心微生物實驗室 上海 200336）

菌落是單個菌體或孢子在一定的固體培養基上生長繁殖后形成的肉眼可見的微生物聚集體，菌落形態（大小、形狀、邊緣、顏色等）是辨認和鑒定菌種的重要標志。研究表明菌落特征與細菌表型和分子特征相關［1-2］，基因水平的變化會導致菌落形態的改變［2-4］，同一種屬的病原菌基因型不同，菌落形態往往也不同，區別菌落形態有助于快速鑒別細菌種屬，甚至輔助鑒別基因型。

化膿性鏈球菌屬A群β溶血鏈球菌，能引起猩紅熱、丹毒、新生兒敗血癥、腦膜炎、產褥熱以及鏈球菌變態反應性疾病等。菌落形態是實驗室初步判斷化膿性鏈球菌的重要依據，化膿性鏈球菌在37℃培養18～24 h后，在血瓊脂平板上一般形成直徑約0.5 mm、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑或略粗糙、半透明或透明、β溶血的灰白色菌落［5］。表型由基因型決定，研究表明一些細菌基因的變化會導致同一種屬細菌的菌落形態變化［6-7］。目前微生物實驗室對菌落的觀察多停留在傳統的認知階段，未能更進一步區分菌落形態的細微差異，我們在對化膿性鏈球菌分離培養鑒定的過程中發現不同emm基因型分離株的菌落形態存在明顯差異，各亞菌落特點具有emm基因型特異性，總結如下。

資料和方法

菌株來源來源于上海市閔行區疾病預防控制中心微生物實驗室2019年1—12月自上海市閔行區猩紅熱監測點兒童咽拭子標本中分離培養的化膿性鏈球菌菌株。

菌落形態觀察菌株劃線接種于含5%無菌脫纖維羊血的瓊脂平板（上海科瑪嘉微生物技術有限公司），37℃培養18～24 h，觀察并記錄菌落形態（形狀，大小，溶血等）。

生化確認實驗用化膿性鏈球菌的純培養物配置0.5麥氏濃度菌懸液，加入Vietek GP生化鑒定卡（生物梅里埃）進行生化鑒定，ID%為99%鑒定為化膿性鏈球菌。

emm基因測序及分型emm基因擴增、測序和比對按照美國CDC網站化膿性鏈球菌測序方案進行（https：//www.cdc.gov/streplab/groupa-strep/emm-typing-protocol.html）。以DNA為 模板，用通用引物PCR擴增，上游引物：5′-TATT（C/G）GCTTAGAAAATTAA-3′，下游引物：5′-GCAAGTTCTTCAGCTTGTTT-3′。反應體系為qPCR Mix 15 μL，Mg2+（25 mmol/L）上 下 游 引 物 各0.5 μL，DNA模板2 μL，補充ddH2O至30 μL。PCR擴增程序：94℃1 min；94℃15 s×15；47℃30 s×15；72℃延伸1 min 15 s×15；94℃15 s×15；47℃30 s×15；72℃延伸1 min 15 s，每個循環遞增10 s×15；72℃延伸7 min；4℃保持。委托上海生物人技術有限公司完成PCR擴增產物純化及測序。測序序列提交至數據庫比對（https：//www2a.cdc.gov/ncidod/biotech/strepblast.asp），序列同源性99%判為同一emm基因型。

結果

菌落形態179株化膿性鏈球菌在血平板上菌落大小、表面特征和溶血情況存在肉眼可見的差別，據此分為A、B、C、D 4種菌落形態（圖1）。A：灰白色，約0.5 mm，表面光滑或粗糙，β溶血；B：灰白色，約1 mm，比A菌落大，表面光滑，β溶血；C：3～4 mm，為所有菌落里最大的，黏液型（這是明顯不同于其他3種菌落的特點），β溶血；D：約0.5 mm，表面光滑或粗糙，溶血現象不同于其他3種菌落，介于α溶血和β溶血之間。

菌落形態與emm基因型的關系不同emm基因型的菌落特征明顯不同，同一基因型亞型的菌落特征相同。4種基因型的菌株有與之對應的4種不同的菌落形態（圖1），分別稱之為emm12，emm1，emm3和emm4型菌落（表1）。

表1 179株四種emm基因型化膿性鏈球菌的菌落形態Tab 1 The colony characteristics of four emm genotypes in 179 S.pyogenes

討論表型由基因型決定，表型差異源于基因水平的差異，菌落形態的不同也有其分子生物學基礎。化膿性鏈球菌emm基因編碼膜表面M蛋白，不同emm基因5’端的高變區堿基組成不同，根據這一結構特點把化膿性鏈球菌分成不同的emm基因型，也造成了菌落形態的不同。

化膿性鏈球菌流行emm基因型存在國家/地區差異［8-12］。本研究中化膿性鏈球菌emm基因型和國內外其他學者的研究結果相符［13-16］，主要為emm12型和emm1型（80%～97%），因此就我國大部分地區而言，化膿性鏈球菌的菌落形態也以這兩種常見。這兩個基因型的菌落形態的明顯區別在于菌落大小，emm1型（包含3種亞型）菌落較大，約為emm12型（包含9種亞型）菌落的2倍大小，雖然兩種菌落只有0.5 mm的差異，但在血平板上肉眼非常容易觀察出差別，emm1型菌落溶血環比emm12型菌落大，因此可以憑借菌落大小區別這兩種常見的emm基因型菌株。除此之外，emm1型均為光滑型，而emm12型有光滑型和粗糙型兩種。

與emm12和emm1不 同，emm3和emm4型 在 我國少見報道。和其他emm基因型菌落不同，emm3型菌落屬于黏液型菌落，半透明水滴狀，且菌落是所有化膿性鏈球菌中最大的，約是其他的3倍以上，容易辨別，與Tamayo等［17］對130株emm3型黏液型菌落的描述相符。黏液型化膿性鏈球菌的這一特征具有時效性，Crater等［18］研究表明其在對數生長初期菌落特征最明顯，到生長平臺期這一特征容易消失。我們在研究中也發現這種菌落在培養16～18 h黏液型最明顯，超過24 h則不明顯。因此我們在化膿性鏈球菌分離培養18 h時觀察一次。emm3型菌落屬于黏液型，但并不是所有黏液型都是emm3型，個別黏液型化膿性鏈球菌屬于emm6型［19］。emm3型是歐洲某些國家比較常見的基因型［10］，我國少見報道，也有可能是因為該菌菌落形態比較特殊，不符合典型的化膿性鏈球菌的菌落形態特征，在實驗室檢測中易被忽略。

emm4型菌落不同于其他化膿性鏈球菌的特征是溶血環，介于α溶血和β溶血之間。emm4型菌落的溶血特征可能是由于emm4型菌株編碼溶血素的基因發生改變所致。本研究只分離到2株emm4型化膿性鏈球菌，國內也鮮有報道emm4型分離株，部分原因可能是其非典型的菌落特點導致漏檢。韓國學者曾報道2017年韓國emm4型化膿性鏈球菌突然增多［20］，在化膿性鏈球菌的鑒定過程中應注意觀察具有該特征的菌落，防止emm4型菌落漏檢。

菌落形態是細菌鑒定過程中最早觀察到的特征，根據特有的菌落特征可以初步鑒別種屬。隨著分子生物學技術的發展和認知水平的提高，可以進一步細分同一種屬細菌不同基因型的菌落特點。本研究中檢測出4種emm基因型，菌落特點各有不同。由于我國目前常見的化膿性鏈球菌基因型為emm12和emm1型［13-14］，因此我們在初步鑒別化膿性鏈球菌時，可根據兩種基因型不同的菌落特點早期辨別emm12和emm1型。

綜上所述，化膿性鏈球菌菌落有明顯的emm基因型特異性，不同emm基因型菌落形態不同，同一基因型的各亞型菌落特征相同，可根據菌落形態的基因型特異性輔助早期辨別化膿性鏈球菌的emm基因型。

作者貢獻聲明歐陽霖emm基因測序，論文撰寫。王小光，宋馳萍，張穎華菌株分離培養。陳明亮，張穎華研究設計，論文撰寫。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。