不同emm基因型化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)

歐陽霖王小光宋馳萍陳明亮張穎華△

（1上海市閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心微檢科 上海 201101；2復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院閔行分院 上海 201101；3上海市疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室 上海 200336）

菌落是單個菌體或孢子在一定的固體培養(yǎng)基上生長繁殖后形成的肉眼可見的微生物聚集體，菌落形態(tài)（大小、形狀、邊緣、顏色等）是辨認(rèn)和鑒定菌種的重要標(biāo)志。研究表明菌落特征與細(xì)菌表型和分子特征相關(guān)［1-2］，基因水平的變化會導(dǎo)致菌落形態(tài)的改變［2-4］，同一種屬的病原菌基因型不同，菌落形態(tài)往往也不同，區(qū)別菌落形態(tài)有助于快速鑒別細(xì)菌種屬，甚至輔助鑒別基因型。

化膿性鏈球菌屬A群β溶血鏈球菌，能引起猩紅熱、丹毒、新生兒敗血癥、腦膜炎、產(chǎn)褥熱以及鏈球菌變態(tài)反應(yīng)性疾病等。菌落形態(tài)是實(shí)驗(yàn)室初步判斷化膿性鏈球菌的重要依據(jù)，化膿性鏈球菌在37℃培養(yǎng)18～24 h后，在血瓊脂平板上一般形成直徑約0.5 mm、圓形凸起、邊緣整齊、表面光滑或略粗糙、半透明或透明、β溶血的灰白色菌落［5］。表型由基因型決定，研究表明一些細(xì)菌基因的變化會導(dǎo)致同一種屬細(xì)菌的菌落形態(tài)變化［6-7］。目前微生物實(shí)驗(yàn)室對菌落的觀察多停留在傳統(tǒng)的認(rèn)知階段，未能更進(jìn)一步區(qū)分菌落形態(tài)的細(xì)微差異，我們在對化膿性鏈球菌分離培養(yǎng)鑒定的過程中發(fā)現(xiàn)不同emm基因型分離株的菌落形態(tài)存在明顯差異，各亞菌落特點(diǎn)具有emm基因型特異性，總結(jié)如下。

資料和方法

菌株來源來源于上海市閔行區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物實(shí)驗(yàn)室2019年1—12月自上海市閔行區(qū)猩紅熱監(jiān)測點(diǎn)兒童咽拭子標(biāo)本中分離培養(yǎng)的化膿性鏈球菌菌株。

菌落形態(tài)觀察菌株劃線接種于含5%無菌脫纖維羊血的瓊脂平板（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司），37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄菌落形態(tài)（形狀，大小，溶血等）。

生化確認(rèn)實(shí)驗(yàn)用化膿性鏈球菌的純培養(yǎng)物配置0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙海尤隫ietek GP生化鑒定卡（生物梅里埃）進(jìn)行生化鑒定，ID%為99%鑒定為化膿性鏈球菌。

emm基因測序及分型emm基因擴(kuò)增、測序和比對按照美國CDC網(wǎng)站化膿性鏈球菌測序方案進(jìn)行（https：//www.cdc.gov/streplab/groupa-strep/emm-typing-protocol.html）。以DNA為 模板，用通用引物PCR擴(kuò)增，上游引物：5′-TATT（C/G）GCTTAGAAAATTAA-3′，下游引物：5′-GCAAGTTCTTCAGCTTGTTT-3′。反應(yīng)體系為qPCR Mix 15 μL，Mg2+（25 mmol/L）上 下 游 引 物 各0.5 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)充ddH2O至30 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃1 min；94℃15 s×15；47℃30 s×15；72℃延伸1 min 15 s×15；94℃15 s×15；47℃30 s×15；72℃延伸1 min 15 s，每個循環(huán)遞增10 s×15；72℃延伸7 min；4℃保持。委托上海生物人技術(shù)有限公司完成PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化及測序。測序序列提交至數(shù)據(jù)庫比對（https：//www2a.cdc.gov/ncidod/biotech/strepblast.asp），序列同源性99%判為同一emm基因型。

結(jié)果

菌落形態(tài)179株化膿性鏈球菌在血平板上菌落大小、表面特征和溶血情況存在肉眼可見的差別，據(jù)此分為A、B、C、D 4種菌落形態(tài)（圖1）。A：灰白色，約0.5 mm，表面光滑或粗糙，β溶血；B：灰白色，約1 mm，比A菌落大，表面光滑，β溶血；C：3～4 mm，為所有菌落里最大的，黏液型（這是明顯不同于其他3種菌落的特點(diǎn)），β溶血；D：約0.5 mm，表面光滑或粗糙，溶血現(xiàn)象不同于其他3種菌落，介于α溶血和β溶血之間。

菌落形態(tài)與emm基因型的關(guān)系不同emm基因型的菌落特征明顯不同，同一基因型亞型的菌落特征相同。4種基因型的菌株有與之對應(yīng)的4種不同的菌落形態(tài)（圖1），分別稱之為emm12，emm1，emm3和emm4型菌落（表1）。

表1 179株四種emm基因型化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)Tab 1 The colony characteristics of four emm genotypes in 179 S.pyogenes

討論表型由基因型決定，表型差異源于基因水平的差異，菌落形態(tài)的不同也有其分子生物學(xué)基礎(chǔ)?；撔枣溓蚓鷈mm基因編碼膜表面M蛋白，不同emm基因5’端的高變區(qū)堿基組成不同，根據(jù)這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)把化膿性鏈球菌分成不同的emm基因型，也造成了菌落形態(tài)的不同。

化膿性鏈球菌流行emm基因型存在國家/地區(qū)差異［8-12］。本研究中化膿性鏈球菌emm基因型和國內(nèi)外其他學(xué)者的研究結(jié)果相符［13-16］，主要為emm12型和emm1型（80%～97%），因此就我國大部分地區(qū)而言，化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)也以這兩種常見。這兩個基因型的菌落形態(tài)的明顯區(qū)別在于菌落大小，emm1型（包含3種亞型）菌落較大，約為emm12型（包含9種亞型）菌落的2倍大小，雖然兩種菌落只有0.5 mm的差異，但在血平板上肉眼非常容易觀察出差別，emm1型菌落溶血環(huán)比emm12型菌落大，因此可以憑借菌落大小區(qū)別這兩種常見的emm基因型菌株。除此之外，emm1型均為光滑型，而emm12型有光滑型和粗糙型兩種。

與emm12和emm1不 同，emm3和emm4型 在 我國少見報(bào)道。和其他emm基因型菌落不同，emm3型菌落屬于黏液型菌落，半透明水滴狀，且菌落是所有化膿性鏈球菌中最大的，約是其他的3倍以上，容易辨別，與Tamayo等［17］對130株emm3型黏液型菌落的描述相符。黏液型化膿性鏈球菌的這一特征具有時效性，Crater等［18］研究表明其在對數(shù)生長初期菌落特征最明顯，到生長平臺期這一特征容易消失。我們在研究中也發(fā)現(xiàn)這種菌落在培養(yǎng)16～18 h黏液型最明顯，超過24 h則不明顯。因此我們在化膿性鏈球菌分離培養(yǎng)18 h時觀察一次。emm3型菌落屬于黏液型，但并不是所有黏液型都是emm3型，個別黏液型化膿性鏈球菌屬于emm6型［19］。emm3型是歐洲某些國家比較常見的基因型［10］，我國少見報(bào)道，也有可能是因?yàn)樵摼湫螒B(tài)比較特殊，不符合典型的化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)特征，在實(shí)驗(yàn)室檢測中易被忽略。

emm4型菌落不同于其他化膿性鏈球菌的特征是溶血環(huán)，介于α溶血和β溶血之間。emm4型菌落的溶血特征可能是由于emm4型菌株編碼溶血素的基因發(fā)生改變所致。本研究只分離到2株emm4型化膿性鏈球菌，國內(nèi)也鮮有報(bào)道emm4型分離株，部分原因可能是其非典型的菌落特點(diǎn)導(dǎo)致漏檢。韓國學(xué)者曾報(bào)道2017年韓國emm4型化膿性鏈球菌突然增多［20］，在化膿性鏈球菌的鑒定過程中應(yīng)注意觀察具有該特征的菌落，防止emm4型菌落漏檢。

菌落形態(tài)是細(xì)菌鑒定過程中最早觀察到的特征，根據(jù)特有的菌落特征可以初步鑒別種屬。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和認(rèn)知水平的提高，可以進(jìn)一步細(xì)分同一種屬細(xì)菌不同基因型的菌落特點(diǎn)。本研究中檢測出4種emm基因型，菌落特點(diǎn)各有不同。由于我國目前常見的化膿性鏈球菌基因型為emm12和emm1型［13-14］，因此我們在初步鑒別化膿性鏈球菌時，可根據(jù)兩種基因型不同的菌落特點(diǎn)早期辨別emm12和emm1型。

綜上所述，化膿性鏈球菌菌落有明顯的emm基因型特異性，不同emm基因型菌落形態(tài)不同，同一基因型的各亞型菌落特征相同，可根據(jù)菌落形態(tài)的基因型特異性輔助早期辨別化膿性鏈球菌的emm基因型。

作者貢獻(xiàn)聲明歐陽霖emm基因測序，論文撰寫。王小光，宋馳萍，張穎華菌株分離培養(yǎng)。陳明亮，張穎華研究設(shè)計(jì)，論文撰寫。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。