寧波地區新生兒G6PD缺乏癥基因突變特點及與酶活性的相關性分析

莊丹燕，王飛，潘婕文，潘小莉，潘澍青，陳志央，李海波

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥（G6PDD）是一種因編碼G6PD酶的DNA突變使該酶結構或其活性發生改變，最終影響紅細胞自身抗氧化能力減弱，易被破壞引發溶血黃疸等一系列癥狀的X連鎖不完全顯性遺傳病[1]。G6PD基因突變類型和頻率因地區種族人群差異較大，常見于非洲熱帶、東南亞、地中海和中東區域[2]，我國則以南方地區為主[3]。G6PD酶法檢測受性別、溫度等影響較大[4-5]。本研究針對2018年寧波地區出生的新生兒，行G6PD缺乏癥酶法篩查及基因診斷，以評估G6PD缺乏癥在寧波地區的發病情況，明確寧波地區人群的G6PD基因突變類型和頻率，同時分析基因型與酶活性相關性，為寧波市篩查中心制定本地區最佳的G6PD缺乏癥篩查及確診方案提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集寧波市2018年出生的新生兒78 338名，每例新生兒家長均簽署知情同意書自愿參加免費新生兒疾病篩查。采其足跟血制成干血斑用于篩查，篩查陽性樣本（酶活性≤2.6 U/g Hb）進行基因確診，同一篩查時間段內酶活性介于2.6～3.0 U/g Hb的女性樣本也納入基因檢測。

1.2 方法

1.2.1 G6PD初篩實驗 采用Wallac 1420 VictorTM2及配套G6PD熒光分析試劑盒對新生兒干血斑進行初篩，試驗步驟和結果判讀嚴格按照試劑說明書執行。

1.2.2 G6PD/6GPD生化比值檢測 篩查可疑陽性的患兒召回抽取患兒抗凝血，采用G6PD/6GPD試劑盒（廣州米基）進行確診，G6PD/6GPD＜1視為確診G6PD缺乏。

1.2.3 G6PD基因檢測 采用Lab-Aid824核酸提取儀（廈門致善）提取干血斑標本中基因組DNA，用SLAN-96S實時PCR系統（上海宏石）進行多色探針熒光PCR熔解曲線分析。通過比較待檢標本與野生型對照的熔解峰之間熔點（Tm值）的差異判斷標本是否發生突變及突變的類型。如果沒有發現熱點突變，則對G6PD編碼外顯子進行Sanger測序（NM_001042351.1）。

1.3 統計方法 采用SPSS 13.0軟件進行數據處理，計數資料采用2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 寧波地區G6PD基因突變類型和頻率 78 338例新生兒G6PD篩查中，酶活性≤2.6 U/g Hb的陽性例數405例，介于2.6～3.0 U/g Hb之間的女性95例，共500例樣本納入基因檢測。檢測結果220例未見突變，280例檢出不同位點突變，以1388G＞A突變占比最多（86例，占30.71%，含72例純合突變和14例雜合突變），其次為1376G＞T（77例，占27.50%，含55例純合突變和22例雜合突變）。其中c.1375C＞T、c.350C＞T兩個突變，MMCA檢測結果為未知基因，Sanger測序后發現為這兩個突變。見表1、封三彩圖7。

表1 不同基因突變位點和頻率統計

2.2 基因突變攜帶率在不同G6PD酶活性區間分布情況 經基因檢測的500例樣本，其中男290例，女210例。當G6PD酶活＞2.4 U/g Hb時，男性樣本突變攜帶率＜20%；而女性高達20%～50%。見封三彩圖8。

2.3 G6PD基因型與酶活相關性 比較5種最常見基因突變位點樣本G6PD酶活性差異，不同基因突變位點樣本G6PD初篩濃度值差異有統計學意義（2=8.713，P＜0.05）；95A＞G突變類型G6PD初篩＞2.6 U/g Hb的比例均高于1376G＞T（2=5.377，P＜0.05），見表2。

表2 不同基因突變位點樣本G6PD初篩值比較 例（%）

3 討論

3.1 G6PD基因突變類型和頻率G6PD是一種細胞溶質酶，在胞漿內和細胞膜上均有分布，幾乎所有哺乳動物細胞中都含有G6PD。人類編碼G6PD酶的DNA序列由13個外顯子、12個內含子組成，位于X染色體端粒附近，其完整序列長達16.2Kb[6]。G6PD基因突變以點突變為主,世界范圍已報道400多種突變[7]。我國以c.1388G＞A、c.1376G＞T及c.95A＞G突變為主[8]。本研究發現，寧波地區最常見的前3位基因突變類型為c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.1024C＞T，共占75%；另外c.95A＞G、c.871G＞A和c.392G＞T基因在寧波地區也有較高發生率，分別占10.36%、5.36%及3.21%，與海南省報道的相似[9]。雖然本研究與溫州地區報道的c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.1024C＞T前3位略有不同[10]，但前6位主要突變類型還是基本一致的。本研究還發現3例復合突變：1360C＞T與1388G＞A、95A＞G與1024C＞T、95A＞G與1388G＞A。這3例復合突變均發生于G6PD活性缺乏的女性，這提示該突變可能是雙雜合子，需進一步需完善父母基因檢測結合家系判定結果。

另外，在初篩陽性樣本中檢出兩例未知突變，經基因測序發現是c.1375C＞T、c.350C＞T突變各1例，均未見報道。經數據庫查詢，c.350C＞T突變為第5號外顯子350位置C替換成T，導致氨基酸功能發生改變，絲氨酸轉換成苯丙氨酸；c.1375C＞T突變為第13號外顯子1375位置C替換成T，精氨酸轉換成半胱氨酸，均為錯義突變。

3.2 G6PD基因型與酶活相關性G6PD缺乏癥的遺傳方式是一種伴性不完全顯性遺傳，男性患兒只有半合子，其多表現為酶活性顯著缺乏，而女性因為有兩條X染色體，故可有純合子和雜合子2種。純合子表現為酶活性嚴重缺乏，雜合子因X染色體存在隨機失活現象，體內可同時存在酶缺乏和正常兩種紅細胞，且兩者分布并不均[11]，可表現為酶活性正常或僅輕度降低。本研究顯示，G6PD酶活＞2.4 U/g Hb時，男性樣本突變攜帶率＜20%，而女性高達20%～50%。可見，G6PD基因有突變攜帶的男性酶活性分布在2.4 U/g Hb以下居多；女性酶活性高至3.0 U/g Hb突變攜帶率才降至20%左右。假如不同性別使用同一酶活切值去界定陽性人群，則會導致絕大多數女性雜合子漏篩或男性出現過多假陽性，因此需要對不同性別分設不同陽性截斷值。

本研究結果顯示，871G＞A和95A＞G突變類型，其G6PD初篩＞2.6 U/g Hb的比例顯著高于1376G＞T，這說明該種突變相對1376G＞T，酶活性下降程度較低；而其他4種位點突變酶活性下降程度較高，后續可進一步進行挖掘探討。

3.3 寧波地區篩查診斷模式探討 由于G6PD缺乏癥不完全顯性的特性及突變分布的差異，不同省份對G6PD缺乏癥的檢出存在差異。本研究結果表明，寧波的G6PD新生兒人群突變攜帶率達0.36%（280/78338），低于海南、廣東等高發地區[10,12]，與本省溫州地區相似[9]，略高于溫州的0.3%。寧波地區處于長江以南，隨著近年城市化進程加快，人口流動日益頻繁等因素，本地區的G6PD發病也確實不容忽視。G6PD缺乏癥一旦發病病情嚴重，只能對癥治療，通過新生兒篩查及基因診斷可起到早診斷早預防的效果，并且對女性雜合子的檢出可進一步指導生育。對于G6PD缺乏癥的篩查診斷防治本研究提供了一定依據，也為后續基因型和表型相關研究提供了基礎。