荸薺淀粉合成酶AGPase的基因克隆及表達分析

董偉清，江 文，何芳練*，邱祖楊，蔣慧萍，黃詩宇，劉莉莉，何春紅，楊干德

(1.廣西農業科學院生物技術研究所，廣西 南寧 530007；2. 荔浦市農業農村局，廣西 荔浦 546600)

【研究意義】荸薺[Eleocharisdulcis(N. L. Burman) Trinius ex Henschel]為莎草科多年生淺水草本植物，球莖質脆多汁，主要營養物質為碳水化合物，淀粉是其主要儲藏形式，但在不同品種中差異較明顯[1-2]。植物淀粉生物合成受ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SSs)、淀粉分支酶(SBEs)和脫分支酶(DBEs)的關鍵基因調控[3]，其中AGPase是淀粉生物合成的起始酶和限速酶，其活性直接影響淀粉合成的速率[4]。但迄今關于荸薺AGPase的基因序列和結構等分子生物學特性及其在球莖發育過程中的表達情況尚不明確。因此，克隆荸薺AGPase的基因并對其結構和表達情況進行分析，對研究荸薺淀粉生物合成機制及培育高淀粉荸薺品種具有重要意義。【前人研究進展】高等植物的AGPase是一個異源四聚體(α2β2)，由2個大亞基和2個小亞基構成，大亞基偏重于對酶活性的構象進行調節，小亞基行使AGPase的催化功能[5]。已有研究表明，編碼AGPase的基因表達與淀粉合成速率一致，在淀粉合成中發揮重要作用[6-8]。Beyene等[9]通過轉基因沉默木薯AGPase大亞基基因(MeAPL3)，發現木薯貯藏根的淀粉和干物質含量顯著降低，葉柄/莖角增加，葉片下垂。宋波濤等[10]將sAGP基因導入馬鈴薯，明確了該基因能提高馬鈴薯塊莖淀粉含量。Cheng等[11]通過蓮藕AGPase大亞基基因的多態性開發FMAGPL-I1功能標記，發現含有362 bp片段的40個荷花品種總淀粉含量較少，為提高蓮藕淀粉含量的分子標記輔助選育效率提供了依據。【本研究的切入點】目前，針對荸薺淀粉生物合成的研究僅見通過對葉片和球莖等組織的高通量測序獲得涉及淀粉生物合成相關基因的報道[12-14]，鮮見關于荸薺AGPase的基因克隆、基因序列及其結構等分子生物學特性分析，以及EdAPS1基因在球莖發育過程中表達情況的研究報道。【擬解決的關鍵問題】克隆荸薺編碼AGPase小亞基基因(EdAPS1)的cDNA序列，對其進行生物信息學分析，并采用實時熒光定量PCR檢測EdAPS1基因在不同荸薺組織和球莖發育過程中的表達情況，為探究荸薺淀粉生物合成機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試荸薺為地方品種桂林馬蹄，2019年7月下旬種植于廣西桂林市荔浦市修仁鎮念村示范基地。根據荸薺球莖發育時期，分別于移栽大田后90、100、110和120 d進行地上部和地下部取樣，其中，地上部取葉狀莖，地下部取球莖、匍匐莖和根，洗干凈備用。每次取樣約2.0 g，共取樣4次，3次重復。每次取樣后立即用液氮速凍，最后將速凍樣品置于-80 ℃貯存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 參照天根生化科技(北京)有限公司的植物多糖多酚總RNA提取試劑盒說明，分別從荸薺移栽后不同時期的球莖及移栽后120 d的各組織樣品中提取總RNA。根據天根生化科技(北京)有限公司TIANScript II cDNA第一鏈合成試劑盒說明，將提取的總RNA反轉錄成cDNA第一鏈。

1.2.2EdAPS1基因克隆 以荸薺球莖cDNA為模板，根據荸薺轉錄組測序獲得EdAPS1基因的注釋信息，設計特異克隆引物EdAPS1-F(5′-ACTCTCATTCATTCTCTCTCTC-3′)和EdAPS1-R(5′-TATGGCACTGAACCGAGCAAAC-3′)。PCR反應體系20.0 μl：5×Phusion HF Buffer 4.0 μl，dNTPs(10 mmol/L)0.4 μl，正、反向引物(10 μmol/L)各1.0 μl，Phusion DNA Polymerase(2 U/μl)0.2 μl，cDNA 1.0 μl，ddH2O補至20.0 μl。擴增程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產物在1.0 %瓊脂糖凝膠中電泳檢測。采用北京全式金生物技術有限公司的pEASY-Blunt Cloning Kit將目的片段連接到pEASY-Blunt載體上，然后轉化Trans1-T1感受態細胞，涂布在含100 mg/L Amp的LB平板上。挑取單克隆，以M13正向和反向引物進行PCR陽性檢測，將陽性克隆送至廣州艾基生物技術有限公司測序。

1.2.3EdAPS1基因生物信息學分析 利用NCBI的開放閱讀框(ORF)查找器(ORFfinder)在線工具查找分析EdAPS1基因cDNA序列的ORF；氨基酸序列的同源性比較采用DNAMAN 9完成；采用ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)和SignalP工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測分析EdAPS1蛋白的理化性質和信號肽；利用NCBI的CD-search在線工具進行EdAPS1蛋白功能結構域分析；利用SMART在線數據庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行EdAPS1蛋白結構域預測分析；利用PredictPro(https://www.predictprotein.org/home)在線預測EdAPS1蛋白的二級結構；利用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預測EdAPS1蛋白的三級結構；最后運用MEGA 5.1的鄰近相接法(NJ)構建系統發育進化樹。

1.2.4 基因表達分析 根據獲得的荸薺EdAPS1基因的cDNA序列，利用Primer 5.0設計熒光定量PCR引物EdAPS2-F(5′-GCAGGCGACCACTTATACAGGA-3′)和EdAPS2-R(5′-TGGGCTTCTCGGCAAACTCAA-3′)，以荸薺18S rRNA(GenBank登錄號：MG742686.1)為模板設計熒光定量PCR內參引物CWC1-F(5′-TTGACGGAAGGGCACCACCA-3′)和CWC1-R(5′-TCGCTCCACCAACTAAGAACGG-3′)。熒光定量PCR參照南京諾唯贊生物科技有限公司的2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明操作。擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，進行45個循環。每個樣品設3次重復。利用2-△△Ct方法計算荸薺EdAPS1基因在球莖不同發育期和不同組織中的相對表達量[15]。

2 結果與分析

2.1 荸薺總RNA提取及EdAPS1基因的克隆結果

將提取的荸薺葉片和球莖總RNA進行1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現，28S rRNA和18S rRNA條帶明亮清晰(圖1)，說明所提取的RNA完整性較好，可用于后續的RT-PCR擴增試驗。

以荸薺球莖總RNA反轉錄所得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，得到長度為1716 bp的目的基因片段(圖2)，經連接、轉化和菌落PCR鑒定，得到陽性克隆。通過測序獲得編碼AGPase小亞基基因的cDNA序列，并將其命名為EdAPS1基因，在GenBank公布的登錄號為MT127798。

2.2 EdAPS1基因的生物信息學分析

通過NCBI網站的ORFfinder查找分析，EdAPS1基因的cDNA序列包含1個完整的ORF(1521 bp)，編碼506個氨基酸(圖3)，編碼荸薺AGPase的小亞基。預測EdAPS1蛋白分子量為55.67 kD，分子式為C2469H3896N672O746S23，總原子數為7806，等電點為5.98，負電荷殘基總數(Asp+Glu)為58，帶正電荷的殘基總數(Arg+Lys)為53，不穩定指數為43.56，表明該蛋白不穩定；脂肪指數為88.32，GRAVY平均水平為-0.149，表明該蛋白為親水性蛋白。利用SignalP工具信號肽預測結果顯示，EdAPS1蛋白無信號肽(圖4)。在NCBI中預測EdAPS1蛋白的保守結構域，發現該蛋白氨基酸序列第87～506位與磷酸腺苷酰基轉移酶(Glucose-1-phosphate adenylyltransferase)高度相似，說明該蛋白具有相似的功能，屬于PLN02241超家族(圖5)。根據SMART在線數據庫分析結果，EdAPS1蛋白的氨基酸序列第77～352位為NTP_transferase結構域，第447～489位為PbH1結構域(圖6)，其中，NTP_transferase結構域具有將核苷酸轉移到磷酸糖上的能力；PbH1結構域為平行β-螺旋重復序列，該序列有助于保持蛋白整體穩定，具有該結構域的蛋白通常是以多糖為底物的酶。對EdAPS1蛋白的二級結構和溶劑可及性進行預測，結果(圖7)顯示其二級結構組成比例為螺旋結構(Helix)占16.21 %，鏈狀結構(Strand)占19.17 %，無規則卷曲(Loop)占64.62 %；溶劑可及性分析結果顯示，暴露(Exposed)占32.61 %，埋藏(Buried)占61.26 %，中間型(Intermediate)占6.13 %。EdAPS1蛋白的三級結構由17個α-螺旋、34個β-折疊和52個β-轉角構成(圖8)。

2.3 EdAPS1蛋白的氨基酸序列同源性比對分析及系統進化樹構建

將EdAPS1蛋白的氨基酸序列提交至NCBI進行BLASTp同源性比對，發現EdAPS1蛋白與油莎草(Cyperusesculentusvar.sativus)AGPase小亞基蛋白的同源性最高，一致性為88.69 %。利用DNAMAN 9對11種植物AGPase小亞基蛋白的氨基酸序列進行多重比對，結果(圖9)發現不同植物的AGPase小亞基蛋白氨基酸序列具有較高的同源性。其中，荸薺EdAPS1蛋白與油莎草相應蛋白(ALL29329.1)的親緣關系最近，一致性為86.91 %；與中華獼猴桃(AFO84075.1)、刺毛黧豆(RDX86632.1)、月季花(XP024181373.1)和鳳梨(XP020109479.1)等的親緣關系較遠，一致性為68.80 %～79.64 %。

系統進化樹分析結果(圖10)表明，不同物種AGPase小亞基蛋白主要聚為兩大分支，其中，刺毛黧豆(Mucunapruriens)和歐洲油菜(Brassicanapus)等9個物種聚為一類；荸薺與油莎草2個物種聚為一類。荸薺與油莎草均為莎草科植物，二者間進化關系接近，可推測其AGPase小亞基蛋白的生理特性與生態特征在進化過程中具有相似特性。

2.4 EdAPS1基因的表達水平分析

熒光定量PCR結果(圖11)顯示，EdAPS1基因在荸薺的根、葉狀莖、匍匐莖和球莖中均有表達，其中在球莖中表達量最高，其次為葉狀莖，二者差異顯著(P<0.05，下同)，且均顯著高于在根和匍匐莖中的表達量，而在根中的表達量最低，但與在匍匐莖的表達量差異不顯著(P>0.05，下同)。從圖12可看出，在球莖發育過程中，EdAPS1基因在球莖發育后期(S4，移栽后120 d)的相對表達量最高，且顯著高于其他發育時期，在球莖發育前期和中期(S1～S3，移栽90～110 d)的相對表達量差異不顯著。而荸薺球莖發育后期為體積迅速增大和干物質含量迅速增加期，因此，推測EdAPS1基因在后期高表達與淀粉的快速積累相關。

3 討 論

本研究從荸薺中克隆獲得編碼AGPase小亞基基因EdAPS1的cDNA序列，該序列全長1716 bp，包含1個1521 bp的ORF，編碼506個氨基酸；EdAPS1蛋白的分子量為55.67 kD，理論等電點為5.98，具有NTP_transferase和PbH1結構域；二級結構由螺旋結構(16.21 %)、鏈狀結構(19.17 %)和無規則卷曲(64.62 %)組成；三級結構由17個α-螺旋、34個β-折疊和52個β-轉角構成；EdAPS1蛋白與其他植物APS蛋白具有較高的同源性，在進化上與油莎草親緣關系最近；EdAPS1基因表達主要集中于球莖且在球莖發育后期表達量最高。

本研究發現，荸薺EdAPS1蛋白的結構特征和理化性質與馬鈴薯sAGP蛋白和芋CeAPS1蛋白等較相似，均具有NTP_transferase和PbH1結構域，推測其與馬鈴薯sAGP蛋白和芋CeAPS1蛋白具有相似功能[4，16]，后續可通過轉基因技術進一步驗證。本研究的系統發育進化樹分析結果顯示，荸薺EdAPS1蛋白與油莎草中相應蛋白(ALL29329.1)的親緣關系最近，其中荸薺屬于莎草科荸薺屬(Eleocharis)植物，油莎草屬于莎草科莎草屬(Cyperus)植物，說明AGPase小亞基在同科植物的進化過程中趨于保守，與王立等[4]研究認為芋CeAPS1蛋白與紫萍和蓮等相應蛋白的相似性在80.00 %以上，具有較高保守性的觀點一致。

Siedlecka等[17]將AGPase小亞基基因的啟動子轉入擬南芥后，能在擬南芥的葉片、莖、花和根等部位驅動GUS基因表達，表明AGPase小亞基基因具有廣泛的表達性。本研究熒光定量PCR分析結果與其相似，EdAPS1基因在荸薺球莖、葉狀莖、匍匐莖和根中均有表達，但表達量相對集中在球莖，且在球莖發育后期表達量顯著提高。根據已有研究結果[18-19]，荸薺球莖在發育后期體積迅速增大，干物質含量迅速增加，薄壁細胞中的淀粉粒大量積累、互相擠壓，占據細胞內較多的空間，甚至影響細胞核的形態，說明淀粉積累是影響球莖干物質含量增加的主要因素，推測本研究中荸薺EdAPS1基因在荸薺球莖發育后期表達量顯著提高與淀粉積累呈正相關，可作為闡明荸薺淀粉生物合成機制及培育高淀粉荸薺品種的參考依據。后續應加強淀粉代謝通路上相關酶如淀粉合成酶、淀粉分支酶和脫分支酶的基因功能研究，以期能系統地闡明荸薺淀粉合成的分子機制，為高淀粉荸薺分子育種提供參考依據。

4 結 論

從荸薺中克隆獲得編碼AGPase小亞基基因(EdAPS1)，該基因包含一個1521 bp ORF，編碼506個氨基酸；荸薺的EdAPS1基因具有在球莖表達量最高，尤其在球莖發育后期表達量更高，且顯著高于球莖其他發育時期的特點。