基于“霰彈理論”的中藥湯劑伴侶的研發(fā)策略與實踐：以黃連解毒湯為例

柯秀梅，張立勝，張定堃，仇敏，楊軍宣，王建偉，瞿禮萍，韓麗

1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

3.九江學(xué)院機(jī)械與材料工程學(xué)院，江西 九江 332005

中藥湯劑是真溶液、膠體、乳濁液、混懸液等組成的混合相態(tài)體系。苦味物質(zhì)多以分子態(tài)或膠體形式存在，高度分散，能瞬時形成廣泛而強(qiáng)烈的刺激。中藥湯劑的苦感為復(fù)雜相態(tài)下眾多成分與苦味受體之間復(fù)雜的多對多時空響應(yīng)與綜合疊加效應(yīng)的結(jié)果[1]。單一的掩（矯）味手段如包合[2]、添加苦味受體抑制劑[3]和添加甜味劑在中成藥中取得了一定的效果，但在液體制劑中的使用效果受到包封率、使用量等的限制，難以達(dá)到預(yù)期效果。基于此，本文選擇療效確切、苦味突出的中藥湯劑黃連解毒湯（方中黃連、黃柏極苦，黃芩微苦，梔子苦；已知苦味成分小檗堿、黃柏堿、黃連堿為生物堿，阿魏酸為有機(jī)酸，黃芩苷為黃酮，梔子苷為環(huán)烯醚萜，檸檬苦素為苦味素）為代表，引入“霰彈理論”，借鑒霰彈槍發(fā)彈多、打擊面廣、命中率高的特點，有機(jī)整合現(xiàn)有掩味[環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）包合]、矯味（甜味劑）和兩親性嵌段聚合物的特點，以期形成有效的矯味新策略。針對黃連解毒湯，本文采用從單味藥到湯劑，自單元向整體、各個擊破的策略，對其進(jìn)行矯味研究。即分別從黃連、黃柏、黃芩和梔子4 個單味藥苦味特點及有效矯味到黃連解毒湯方劑的抑苦味工藝進(jìn)行研究，借鑒咖啡伴侶的成功經(jīng)驗，擬開發(fā)中藥湯劑伴侶劑。

1 基于“霰彈理論”的中藥湯劑伴侶思路

1.1 苦味形成機(jī)制

味覺感知的基本單元是味蕾，人類口腔內(nèi)大約有5000 個味蕾，主要分布于舌頭的上表皮[4]。每個味蕾由50～100 個味細(xì)胞組成[5]。根據(jù)顯微結(jié)構(gòu)特征，可將哺乳動物的味細(xì)胞分為I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型4 種細(xì)胞。其中，Ⅱ型細(xì)胞能感知甜、苦和鮮味3 種基本味道[6]。而酸、苦、甜、咸和鮮味分別由不同的味覺受體感知。由于需要識別數(shù)量龐大、結(jié)構(gòu)和特征相異的苦味物質(zhì)，苦味受體亞型最多。目前，已在人類中發(fā)現(xiàn)25 種苦味受體。苦味物質(zhì)與苦味受體相互作用后，經(jīng)過苦味信號傳導(dǎo)，使大腦感受到苦味[7]。

在味覺受體細(xì)胞的信號傳導(dǎo)中，目前已知有2條苦味信號傳導(dǎo)途徑：（1）苦味物質(zhì)與苦味受體（bitter taste receptors，Tas2Rs）結(jié)合，激活α-味導(dǎo)素- 磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE，效應(yīng)酶）-環(huán)核苷酸（cylic nucleotides，cNMP）通路，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）濃度降低，解除對鈣通道的抑制，Ca2+被釋放，最終導(dǎo)致膜去極化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。（2）激活β、γ-味導(dǎo)素-磷脂酶C（phospholipase C，PLC）-1,4,5-三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）/二酰基甘油（diacylglycerol，DAG）通路，磷脂醇β 活化產(chǎn)生IP3和DAG，導(dǎo)致Ca2+釋放[8-9]，見圖1。

圖1 人類味覺細(xì)胞的味覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Fig.1 Taste signal transduction pathway in human taste cells

1.2 中藥湯劑苦味特殊的形成模式

中藥苦味的感知原理與單一成分類似，卻更加復(fù)雜、特殊。首先，中藥苦味成分具有普遍性與多樣性。統(tǒng)計《中國藥典》2020年版發(fā)現(xiàn)超過50%的中藥和中成藥具有不同程度的苦味，超過80%的成方和單味制劑有苦味和/或澀味。尤其是常用的解表藥、清熱解毒藥等，多含有味苦的生物堿、萜類、蒽醌、黃酮、多酚、糖苷和苦味素等成分。

其次，湯劑是一個包括真溶液、膠體、乳濁液和混懸液等復(fù)雜的混合相態(tài)體系，其化學(xué)成分亦具有多態(tài)性。同一湯液，不同相態(tài)中的化學(xué)成分組成和含量各異，同一種類成分可能同時存在于多種相態(tài)中[10]。與單一成分的溶液相比，湯液在服藥時進(jìn)入口腔后，真溶液中的苦味成分分子和離子刺激苦味受體，形成苦味感知。而包埋在膠體顆粒中和懸浮于混懸液的苦味成分受狀態(tài)限制，在入口到吞咽的瞬間苦味信號被屏蔽，影響了其對苦味受體的激活。

再次，中藥湯液在煎煮中，很多苦味成分如糖苷類、黃酮類、生物堿類、萜類和苦味素類等被煎出。這些成分在形成苦味刺激時，有的成分能同時激活多個苦味受體，有的苦味受體能被多個成分同時激活（圖2），最后輸出的苦味結(jié)果為各成分和相應(yīng)受體不同時間作用的累積疊加[3]。即成分和相態(tài)體系復(fù)雜的中藥湯液的苦味是濃度和時間先后集合與疊加的結(jié)果，顯著放大了刺激效果，使其苦味強(qiáng)烈持久。

圖2 中藥湯劑苦味信號形成模式示意圖Fig.2 Schematic diagram of bitter signal formation mode of raditional Chinese medicine decoction

當(dāng)m個化合物刺激n個苦味受體時，產(chǎn)生的苦味刺激結(jié)果為Bij。當(dāng)化合物Ci激活苦味受體Tj時，形成苦味信號，Bij（苦味感知）為正值；當(dāng)化合物Ci對苦味受體Tj無刺激時，不形成苦味信號，Bij為零；當(dāng)苦味受體Tj被化合物Ci抑制時，則苦味信號傳導(dǎo)受到抑制，Bij為負(fù)值。

綜上所述，中藥苦味的特殊之處在于眾多成分與苦味受體之間復(fù)雜的多對多時空響應(yīng)與綜合疊加效應(yīng)，這是“良藥苦口”的生物化學(xué)機(jī)制。

1.3 現(xiàn)有掩味與矯味技術(shù)在中藥液體制劑中的適宜性分析

針對苦味感知途徑與機(jī)制，目前主要包括掩味與矯味（呈味物質(zhì)相互作用）2 類技術(shù)。

1.3.1 掩味技術(shù) 掩味是指物理隔離苦味物質(zhì)，如CD 包合、微囊等。但這類方法在液體制劑中的應(yīng)用面臨諸多挑戰(zhàn)。以β-CD 包合為例，往往要求主客體分子之間的空間匹配、能量適合，目前較多應(yīng)用于中藥單一成分或某味藥提取物的掩味，且水溶性差，不適宜于湯劑掩味。但實際應(yīng)用中，中藥所含成分相對分子質(zhì)量跨度大、結(jié)構(gòu)各異，理想裝載客體分子或苦味基團(tuán)的難度較大，且受制于包封率的影響，效果并不理想。

1.3.2 矯味技術(shù)

（1）抑制苦味受體：抑制苦味受體是指針對性地采用苦味受體抑制劑，與苦味物質(zhì)競爭結(jié)合苦味受體，抑制受體活性，或誘導(dǎo)受體異構(gòu)化，阻斷苦味感知細(xì)胞內(nèi)信號的形成等。如安賽蜜、腸二醇、γ-氨基丁酸等。這是近年來備受關(guān)注的方法，但這類方法在中藥制劑中的應(yīng)用面臨較多難題。第一，苦味受體亞型眾多，尚缺乏廣譜受體抑制劑，難以適用于中藥復(fù)方制劑。第二，苦味受體廣泛分布于腦、呼吸道[11]、腎、胃、十二指腸等臟器，單純抑制苦味受體，可能影響多臟器的生理功能[12]。

（2）呈味物質(zhì)干擾苦味信號的傳導(dǎo)：目前發(fā)現(xiàn)，添加甜味、鮮味物質(zhì)對部分物質(zhì)的苦味感知有干擾作用。甜、鮮、苦3 種味覺受體類型雖不一致，但他們的受體和信號傳導(dǎo)通路均存在于Ⅱ型味覺細(xì)胞中，并且感知通路存在部分重疊。人工甜味劑刺激的甜味反應(yīng)通路與苦味β、γ-味導(dǎo)素-PLC-IP3/DAG通路一致，代謝四型谷氨酸受體誘導(dǎo)的鮮味反應(yīng)通路與α-味導(dǎo)素-PDE-cNMP 通路相同。當(dāng)味覺信號傳遞至突觸部分，苦味與甜味的信號傳導(dǎo)開始競爭。由于苦味和甜味傳導(dǎo)過程中的正負(fù)反饋交織、相互抑制的綜合博弈，使得大腦感知的結(jié)果是苦甜并存，甚至伴隨奇怪的兼味，這也解釋了單純使用甜味劑難以完全抑苦矯味的現(xiàn)象。

客觀而言，甜味劑的使用對于部分中成藥取得了較好效果[13]，如在中成藥中使用較多的阿斯巴甜[14]、甜菊素[15]和紐甜。但“苦甜并存”的口感仍是常態(tài)。人類苦味受體數(shù)量多、閾值低、感知占優(yōu)勢，一旦藥物中苦味物質(zhì)作用強(qiáng)、濃度高時，苦味信號傳遞占據(jù)絕對優(yōu)勢，甜味劑作用難以凸顯。如小兒感冒口服液、小兒退熱口服液等兒童制劑，盡管使用了甜味劑，苦味仍然很突出。

傳統(tǒng)的物理隔離、抑制苦味受體、混淆苦味感知在中藥液體制劑的抑苦應(yīng)用均有其局限性，為了確保用藥安全，亟需在不干擾受體功能的前提下，尋找新的抑苦手段與策略。

1.4 實現(xiàn)中藥液體制劑抑苦新模式

苦味感知的生理機(jī)制極其復(fù)雜，至今尚無明確的苦味感覺生物學(xué)機(jī)制。比如，為何結(jié)構(gòu)各異的化合物能呈現(xiàn)同種苦味？這可能與苦味受體及其信號傳導(dǎo)有關(guān)。而苦味物質(zhì)（配體）與受體的結(jié)合是苦味形成的第一步。目前，關(guān)于苦味物質(zhì)如何激活受體，主要有空間專一性學(xué)說、內(nèi)氫鍵學(xué)說[16]與三點接觸理論，廣為認(rèn)可的是三點接觸理論。三點接觸理論認(rèn)為，苦味模式包括親電性基團(tuán)AH、親核基團(tuán)B 及疏水基團(tuán)X 3 個部分，當(dāng)苦味物質(zhì)AH 與受體A′結(jié)合，X 與受體X′結(jié)合，B′位置懸空[17]時，則產(chǎn)生苦味。

綜合來看，苦味感知的觸發(fā)須同時具備2 個條件：一是苦味成分結(jié)構(gòu)上的AH 與受體A′結(jié)合，如-NO2、＝N、＝N-、-SH、-S-、-SO2H、-S-S、＝C＝S 等；二是苦味成分的疏水性基團(tuán)與受體多烯磷脂疏水口袋之間形成疏水作用。

基于上述分析，本文提出在液體狀態(tài)下，添加兩親性嵌段聚合物，一方面，利用其疏水端屏蔽苦味分子的疏水基團(tuán)，親水端在成分與受體之間形成阻隔，以期實現(xiàn)苦味成分的“隱形修飾”[18]；另一方面，兩親性嵌段聚合物的加入增加了原體系中膠體相的占比，使得苦味物質(zhì)重新分配，降低其在真溶液中的分配量和濃度，減少苦味成分與受體的直接接觸和刺激，達(dá)到抑苦效果。即通過兩親性嵌段聚合物屏蔽疏水基團(tuán)是實現(xiàn)中藥苦味成分“隱形修飾”的可能途徑。

1.5 基于“霰彈理論”矯味

中藥湯液中苦味成分對苦味受體的作用具有多成分、多靶點和多層次的特點，類似于“集團(tuán)軍式作用”，為其矯味帶來巨大的挑戰(zhàn)。采用單一矯味方法對中藥湯液進(jìn)行矯味，就好像打仗中單兵面對眾多敵軍的作戰(zhàn)，很可能寡不敵眾，抑苦效果難達(dá)預(yù)期。因此，本文引入“霰彈理論”對中藥湯液進(jìn)行矯味。與步槍相比，霰彈具有單次射擊子彈多、覆蓋面廣、命中率高，造成多部位、大面積、多層次和多系統(tǒng)、整體打擊的的特點。

本文將CD 掩味、人工甜味劑矯味和聚合物“隱形修飾”苦味成分而抑苦的多種矯味途徑進(jìn)行有機(jī)整合，以期在類似作用中產(chǎn)生“疊加作用”，不同作用間形成“協(xié)同作用”，以達(dá)到1＋1＋1＞3 的效果。在提高矯味效果的同時，減少單一矯味劑的使用量，避免大量使用某單一矯味劑而帶入其他不良風(fēng)味和不良反應(yīng)，如甜菊糖苷的苦澀味、部分人工甜味劑的金屬味和對腸道菌群、代謝等的影響。

基于“霰彈理論”的矯味策略，作用范圍從切斷苦味信號形成的源頭（隔斷受體與配體接觸）到干擾信號的形成和傳導(dǎo)過程（競爭苦味信號形成和傳導(dǎo)通路中的靶點），實現(xiàn)多層次、大面積的整體矯味效果，有望為中藥湯劑矯味提供有效可行的策略。

苦味成分通常具有一定的疏水性，在混雜了真溶液、膠體和混懸液的中藥湯液這個復(fù)雜體系中，苦味成分的分布也具有多樣性：有的僅存在于真溶液、膠體或混懸液中，而有的則同時分布于其中的2 相（如真溶液和膠體）或3 相（真溶液、膠體和混懸液）中。這種分布處于動態(tài)平衡中，隨著時間和外界條件如溫度、pH 值和其他條件（如兩親性聚合物的加入）的改變而發(fā)生變化。不同相態(tài)中的苦味成分都能對苦味受體形成刺激，其中以真溶液中的成分刺激效果最強(qiáng)。

加入伴侶劑后，中藥湯液中原來的相態(tài)和苦味成分分布的平衡被打破：兩親性嵌段聚合物在增加體系中膠體占比的同時減少了真溶液中苦味成分的分布；包合物（如γ-CD）能結(jié)合真溶液中苦味成分的疏水基團(tuán)，將更多苦味成分分子“裝”入“桶”內(nèi)。以上為從藥的角度，對苦味成分層層防護(hù)，隔斷苦味成分與受體的接觸，阻止苦味信號的形成；“漏網(wǎng)之苦”則從人的角度，以矯味劑（如甜味劑）干擾苦味信號的形成或傳導(dǎo)。

綜上所述，本策略的矯味宗旨為基于“霰彈理論”，分別從藥和人的角度，湯液相態(tài)、真溶液中的苦味成分及其電子云狀態(tài)以及苦味信號傳導(dǎo)的起始和過程進(jìn)行多角度、多層次的矯味，實現(xiàn)在苦味受體激活前到臨激活，再到被漏網(wǎng)的苦味成分激活后對其進(jìn)行全方位的整體阻擊攔截，以達(dá)到強(qiáng)效矯味之功。

2 以黃連解毒湯為例的矯味實踐

2.1 模型藥黃連解毒湯的選擇依據(jù)

黃連解毒湯是由黃連、黃芩、黃柏和梔子4 味藥組成的復(fù)方，功能瀉火解毒，主治三焦火毒熱盛之證，為清熱解毒的代表方和基礎(chǔ)方。該方味極苦，略酸，嚴(yán)重影響成人和兒童的服藥順應(yīng)性。方中黃連、黃柏極苦，黃芩微苦，梔子苦中夾酸，已知苦味成分小檗堿、黃柏堿、黃連堿為生物堿，阿魏酸為有機(jī)酸，黃芩苷為黃酮，梔子苷為環(huán)烯醚萜，檸檬苦素為苦味素，具有很好的代表性。對4 味藥水煎液的研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苦味微弱，黃連和黃柏味極苦且后味綿長（尤其是黃連），梔子味苦微酸，即黃連解毒湯的苦味主要來自于黃連、黃柏和梔子，且黃連對其后味貢獻(xiàn)最大。故針對黃連、黃柏和梔子的苦味進(jìn)行矯味，采用志愿者感官評價法，篩選黃連解毒湯的伴侶劑。

2.2 定量描述分析（quantitative description analysis，QDA）評價抑苦效果[19-20]

采用QDA 評價抑苦效果。借用對甜味劑感官評價的指標(biāo)定義，篩選4 個感官特征及其參照物，如表1 所示，按表中內(nèi)容對評價人員進(jìn)行培訓(xùn)。感官評價實驗重復(fù)2 次。甜度值越大越甜，苦度值越大越苦。

表1 感官評價術(shù)語Table 1 Sensory evaluation terms

在評定2 h 前，采用蒸餾水配制各溶液，配好的溶液在（40±1）℃的恒溫水浴中保持溫?zé)釥顟B(tài)。每次提供25 mL 樣品并隨機(jī)編碼，隨機(jī)品嘗評價。評價者評價后吐出所有樣品，每個樣品品嘗間休息1 min 以減少上一次樣品的余味影響。評定時用純凈水和無糖饅頭去除上一個樣品的殘留味道。評定室溫度保持在（25±2）℃。

感官評價小組由12 位評價員組成（7 位男生和5 位女生），年齡在18～25 歲，是九江學(xué)院生命科學(xué)與藥學(xué)院的本科生與研究生。感官評價小組成員通過基本味道識別和閾值測定對甜味（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的蔗糖）和苦味（劑量為16 mg/kg 的奎寧）的區(qū)別能力進(jìn)行篩選確定。

2.3 藥液質(zhì)量濃度的選擇

預(yù)實驗分別以0.02%紐甜對0.05、0.1、0.2、0.3 g/mL（生藥量）黃連、黃柏、梔子和黃連解毒湯水煎液進(jìn)行矯味。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度低時藥液苦味低，易于矯味，但藥液量大，影響患者服藥順應(yīng)性；質(zhì)量濃度高時藥液太苦，難以實現(xiàn)志愿者評分。綜合考慮，0.1 g/mL 單味藥和0.2 g/mL 黃連解毒湯的樣品質(zhì)量濃度適合本矯味實驗。黃連解毒湯臨床用量為30 g/d（生藥量），3 次/d，50 mL/次，符合臨床用藥規(guī)律。

2.4 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 21.0（美國IBM公司）軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2.5 針對各藥苦味特征的矯味

2.5.1 種類篩選

（1）甜味劑：不同種類和來源的甜味劑，其口感特征和甜度差異顯著，本實驗從不同種類和甜度的甜味劑中選擇代表性甜味劑進(jìn)行矯味。從糖醇類的D-甘露醇（甜度為0.57～0.72），糖類中的經(jīng)典甜味劑蔗糖（甜度為1.0），配糖體中的羅漢果甜苷（甜度為200）和甜菊糖苷（甜度為180～200），蛋白質(zhì)中的索馬甜，人工甜味劑中的三氯蔗糖（甜度為600）、阿斯巴甜（甜度為200）和紐甜（甜度為7000～13 000）中選出矯味效果極顯著優(yōu)于其他甜味劑的紐甜（圖3），有效矯味濃度為0.020%（表2）。甜度過高則易引起甜膩感，濃度過低則矯味效果不佳，

圖3 甜味劑的篩選結(jié)果 ( ± s, n = 12)Fig.3 Results of sweeter masking ( ± s, n = 12)

表2 紐甜濃度初篩 ( ± s, n = 12)Table 2 Primary screening of neotame concentration ( ± s, n = 12)

表2 紐甜濃度初篩 ( ± s, n = 12)Table 2 Primary screening of neotame concentration ( ± s, n = 12)

與矯味前的湯液比較：**P＜0.01；經(jīng)0.010%紐甜矯味的湯液與經(jīng)0.001%紐甜矯味的湯液比較：ΔΔP＜0.01；經(jīng)0.020%紐甜矯味的湯液與經(jīng)0.010%紐甜矯味的湯液比較：◆◆P＜0.01；經(jīng)0.040%紐甜矯味的湯液與經(jīng)0.020%紐甜矯味的湯液比較：??P＜0.01；經(jīng)0.060%紐甜矯味的湯液與經(jīng)0.040%紐甜矯味的湯液比較：?P＜0.05**P ＜ 0.01 vs decoction before taste masking; ΔΔP ＜ 0.01 decoction after taste masking by 0.010% neotame vs decoction after taste masking by 0.001% neotame; ◆◆P ＜ 0.01 e decoction after taste masking by 0.020% neotame vs decoction after taste masking by 0.01% neotame; ??P ＜ 0.01 decoction after taste masking by 0.040% neotame vs decoction after taste masking by 0.020% neotame; ?P ＜ 0.05 decoction after taste masking by 0.060% neotame vs decoction after taste masking by 0.040% neotame

口感 矯味前評分 矯味后評分 0.001% 0.010% 0.020% 0.040% 0.060% 入口苦 10.9±1.4 9.3±0.4** 5.5±0.1**ΔΔ 2.8±0.5**◆◆ 2.3±0.1** 1.4±0.3**? 余苦味 11.6±1.2 9.0±0.2** 7.3±0.3**ΔΔ 2.0±0.2**◆◆ 1.9±0.2** 2.1±0.2** 入口甜 0 5.5±0.5** 8.4±0.6**ΔΔ 10.0±0.7**◆◆ 5.0±0.3**?? 6.5±1.5** 余甜味 0 5.0±0.9** 6.0±0.8** 10.0±1.2**◆◆ 6.2±1.3**?? 5.9±0.6**

預(yù)實驗結(jié)果表明，0.02%紐甜溶液為甜度適中，且矯味效果佳，故本實驗以0.02%紐甜溶液為最佳甜度10；苦味越低越好，且為與甜度值平衡，此處取苦味評價值倒數(shù)的50 倍作為統(tǒng)計值。本實驗發(fā)現(xiàn)，甜味劑的甜度越高，對黃連、黃柏、梔子和黃連解毒湯的抑苦效果就越好，特別是對黃連和黃柏等苦味強(qiáng)烈、持久的中藥。如紐甜，它不僅能顯著降低藥物的入口苦味，還高度抑制了其余味苦，達(dá)到有效矯味的效果。

（2）CD：由于黃連和黃柏等目標(biāo)藥物苦味太強(qiáng)，低濃度的CD 不能有效抑制其苦味。而β-CD 的溶解度遠(yuǎn)低于γ-CD，僅1.85%，故本實驗選擇γ-CD作為矯味劑之一，結(jié)果見圖4。γ-CD 能顯著抑制各藥的苦味和梔子、黃連解毒湯的酸味，有效掩味濃度為1.6%，見表3。但經(jīng)其矯味后的黃連、黃柏和黃連解毒湯的苦味仍然較強(qiáng)。

圖4 γ-CD 的掩味結(jié)果 ( ± s, n = 12)Fig.4 Results of bitter masking of γ-CD ( ± s, n = 12)

（3）聚合物：自常用表面活性劑聚山梨酯20、CC497、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188 以及兩親性嵌段聚合物mPEG2000-PCL2000、mPEG5000-PLLA5000、PLLA2000-PEG2000-PLLA2000、mPEG2000-PDLLA2000和mPEG2000-PLLA2000中選出能顯著削弱黃連、黃柏、梔子和黃連解毒湯苦味、并調(diào)和各樣品入口口感的mPEG2000-PLLA2000，見圖5，有效濃度為0.15%，見表4。

綜上所述，篩選出對梔子苦味和酸味有較好掩蔽效果的1.6% γ-CD，能削弱黃連、黃柏、梔子和黃連解毒湯的苦味并調(diào)和其入口口感的0.15% mPEG2000-PLLA2000和能顯著抑制黃連和黃柏的苦味（入口苦和余味苦）的0.02%紐甜，3 者合用能顯著改善黃連解毒湯的患者服藥順應(yīng)性。

2.5.2 伴侶劑配方優(yōu)化 星點設(shè)計-效應(yīng)面（centralcomposite design-response surface method，CCD-RSM）實驗設(shè)計，基于單因素篩選結(jié)果，設(shè)定紐甜取值水平為0.01%～0.03%、mPEG2000-PLLA2000 為0.1%～0.2%、γ-CD 為1.0%～2.0%，采用Design-Expert V8.0.6.1 軟件對黃連解毒湯的矯味伴侶劑處方進(jìn)行CCD-RSM 設(shè)計，以優(yōu)化伴侶劑配方。選擇紐甜、mPEG2000-PLLA2000和γ-CD 為影響黃連解毒湯感官評分的考察因素，紐甜、mPEG2000-PLLA2000、γ-CD 的用量分別用X1（%）、X2（%）、X3（%）表示，X1、X2和X3為自變量，經(jīng)矯味后黃連解毒湯的入口苦味Y1（分）、入口甜味Y2（分）、后苦味Y3（分）和后甜味Y4（分）為考察指標(biāo)，進(jìn)行3 因素3 水平（?1，0，1）的CCDRSM 實驗，經(jīng)Design-Expert V8.0.6.1 軟件設(shè)計20組實驗組合，見表5。

表3 γ-CD 濃度的初篩 ( ± s, n = 12)Table 3 Primary screening of γ-CD concentration ( ± s, n = 12)

表3 γ-CD 濃度的初篩 ( ± s, n = 12)Table 3 Primary screening of γ-CD concentration ( ± s, n = 12)

與掩味前的湯液比較：**P＜0.01；經(jīng)0.4% γ-CD 掩味的湯液與經(jīng)0.2% γ-CD 掩味的湯液比較：ΔP＜0.05 ΔΔP＜0.01；經(jīng)0.8% γ-CD 掩味的湯液與經(jīng)0.4% γ-CD 掩味的湯液比較：◆◆P＜0.01；經(jīng)1.6% γ-CD 掩味的湯液與經(jīng)0.8% γ-CD 掩味的湯液比較：??P＜0.01**P ＜ 0.01 vs decoction before taste masking; ΔP ＜ 0.05 ΔΔP ＜ 0.01 decoction after taste masking by 0.4% γ-CD vs decoction after taste masking by 0.2% γ-CD ; ◆◆P ＜ 0.01 decoction after taste masking by 0.8% γ-CD vs decoction after taste masking by 0.4% γ-CD; ??P ＜ 0.01 decoction after taste masking by 1.6% γ-CD vs decoction after taste masking by 0.8% γ-CD

口感 掩味前 評分 掩味后評分 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% 1.6% 3.2% 6.4% 10.0% 入口苦 10.9±1.4 8.6±1.0** 8.0±0.9** 7.3±0.6**Δ 6.1±0.7**◆◆ 5.0±0.6**? 4.3±0.4** 4.7±0.3** 4.0±0.7** 余苦味 11.6±1.2 7.9±1.1** 7.7±0.8** 6.8±0.9**ΔΔ 6.4±1.0** 4.3±0.4**?? 4.3±0.6** 5.1±1.0** 4.6±0.6** 甜 0 0 0 0 0 0 1.3±0.6** 3.4±0.5** 5.6±0.6**

圖5 聚合物對黃連解毒湯及各單味藥的抑苦效果 ( ± s, n = 12)Fig.5 Effect of polymer on bitterness of Huanglian Jiedu Decoction and each herb ( ± s, n = 12)

表4 mPEG2000-PLLA2000 濃度初篩 ( ± s, n = 12)Table 4 Primary screening of mPEG2000-PLLA2000 concentration ( ± s, n = 12)

表4 mPEG2000-PLLA2000 濃度初篩 ( ± s, n = 12)Table 4 Primary screening of mPEG2000-PLLA2000 concentration ( ± s, n = 12)

與抑苦前的湯液比較：**P＜0.01；經(jīng)0.10% mPEG2000-PLLA2000 抑苦的湯液與經(jīng)0.05% mPEG2000-PLLA2000 抑苦的湯液比較：ΔP＜0.05 ΔΔP＜0.01；經(jīng)0.15% mPEG2000-PLLA2000 抑苦的湯液與經(jīng)0.10% mPEG2000-PLLA2000 抑苦的湯液比較：◆P＜0.05**P ＜ 0.01 vs decoction before taste masking; ΔP ＜ 0.05 ΔΔP ＜ 0.01 decoction after taste masking by 0.10% vs decoction after taste masking by 0.05% mPEG2000-PLLA2000 ; ◆P ＜ 0.05 decoction after taste masking by 0.15% vs decoction after taste masking by 0.10% mPEG2000-PLLA2000

口感 抑苦前評分 抑苦后評分 0.05% 0.10% 0.15% 0.20% 0.25% 入口苦 10.9±1.4 8.9±0.9** 7.9±1.3**Δ 6.8±0.9**◆ 6.2±1.3** 6.1±1.0** 余苦味 11.6±1.2 8.8±1.0** 6.9±0.8**ΔΔ 6.1±0.4** 6.5±1.0** 6.0±1.3**

2.5.3 數(shù)據(jù)分析與最優(yōu)方案驗證[21]

（1）數(shù)據(jù)回歸分析：以回歸模型的擬合度、失擬項、決定系數(shù)和校正系數(shù)為綜合指標(biāo)，選擇2FI、線性、二次方程、三次方程4 種數(shù)學(xué)模型中的最優(yōu)模型，結(jié)果見表6，4 種模型中，2FI 為各響應(yīng)值的最適模型。Y1＝4.390－0.460X1－0.150X2＋0.094X3－0.290X1X2＋0.140X1X3－0.370X2X3＋0.089X1X2X3；Y2＝4.300＋0.550X1＋0.077X2－0.006X3＋0.600X1X2＋0.004X1X3＋0.220X2X3＋0.089X1X2X3；Y3＝4.330－0.430X1－0.093X2＋0.046X3－0.340X1X2＋0.190X1X3－0.310X2X3－0.006X1X2X3；Y4＝3.530＋0.540X1－0.001X2＋0.041X3＋0.350X1X2－0.087X1X3＋0.410X2X3＋0.087X1X2X3。

（2）方差分析：經(jīng)方差分析結(jié)果知，4 個響應(yīng)值選擇的擬合模型P＜0.05，即本實驗中采用的2FI模型顯著，擬合度佳。失擬項表示模型實際值與預(yù)測值不擬合概率，本實驗中4 個擬合方程的失擬項P＞0.05，無顯著差異，即回歸模型在研究區(qū)域中無失擬情況，且信噪比均＞4，表明實驗誤差小，實驗數(shù)據(jù)可靠度高。4 個響應(yīng)值的回歸模型均能用于紐甜、mPEG2000-PLLA2000和γ-CD 3 種矯味劑用量進(jìn)行優(yōu)化，同時能預(yù)測其協(xié)同作用于黃連解毒湯的綜合感官影響，且證明了黃連解毒湯綜合感官與矯味伴侶劑存在顯著的相關(guān)性，即實驗設(shè)計科學(xué)合理。

（3）效應(yīng)面分析及預(yù)測：為進(jìn)一步探索因素間的協(xié)同作用，對經(jīng)Design-Expert V8.0.6.1 軟件及2FI方程繪制的響應(yīng)值受考察因素影響的二維等高線圖和三維曲線圖進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6。

表5 CCD-RSM 實驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of CCD-RSM

表6 數(shù)據(jù)回歸分析結(jié)果Table 6 Regression analysis results of data

圖6 矯味效果中伴侶劑相互作用的二維等高線圖和三維曲線圖Fig.6 Two-dimensional contour diagram and three-dimensional curve diagram of interaction of partner agents in taste masking effects

對于入口苦味的抑制，γ-CD 和mPEG2000-PLLA2000的協(xié)同作用最強(qiáng)，其次為紐甜和 mPEG2000-PLLA2000，γ-CD 和紐甜的協(xié)同作用最差。對于后苦味，紐甜和mPEG2000-PLLA2000的協(xié)同抑制效果最佳，其次為γ-CD和紐甜，γ-CD和mPEG2000-PLLA2000的相互協(xié)同作用最差。對于入口甜味的貢獻(xiàn)，紐甜和 mPEG2000-PLLA2000、γ-CD 和紐甜、γ-CD 和mPEG2000-PLLA2000的的協(xié)同作用依次減弱。對于后甜味的貢獻(xiàn)，γ-CD 和mPEG2000-PLLA2000、紐甜和mPEG2000-PLLA2000、紐甜和γ-CD 的協(xié)同作用依次遞減。對黃連解毒湯入口苦味的抑制效果，各矯味劑的貢獻(xiàn)由大到小依次為紐甜、γ-CD、mPEG2000-PLLA2000。對黃連解毒湯后苦味的抑制效果，各矯味劑的貢獻(xiàn)由大到小依次為紐甜、mPEG2000-PLLA2000、γ-CD。甜味來源于紐甜。

綜上所述，本伴侶劑中各矯味劑各有所長、協(xié)同增效，共奏對黃連解毒湯的矯味和增甜之效，達(dá)到1＋1＋1＞3 的效果，缺一不可。

（4）最優(yōu)方案驗證：Y1和Y3分別為加入矯味伴侶劑后黃連解毒湯的入口苦和余味苦的得分，越小越好，取最小值；Y2和Y4分別為入口甜和余味甜的得分，在0～10 內(nèi)越大越好，故取最大值。優(yōu)化后的最佳配方為紐甜-mPEG2000-PLLA2000-γ-CD-黃連解毒湯的質(zhì)量比為0.028∶0.15∶1.5∶100，4 個指標(biāo)的預(yù)測評分結(jié)果分別為3.5、4.5、3.0、3.5。

最優(yōu)配方驗證結(jié)果及其口感評分真實值與預(yù)測值結(jié)果見圖7。優(yōu)化配方各指標(biāo)的真實值與預(yù)測值接近。表明CCD-RSM 設(shè)計能優(yōu)化黃連解毒湯的矯味伴侶劑配方配比，優(yōu)化配方實現(xiàn)了對黃連解毒湯口感的改善。

圖7 優(yōu)化配方評分結(jié)果 (A) 及真實評分值與預(yù)測值相關(guān)性 (B)Fig.7 Scoring results of optimized prescription (A) and correlation between real score and predicted value (B)

采用IBM SPSS 21 軟件對經(jīng)CCD-RSM 優(yōu)化處方的伴侶劑矯味后黃連解毒湯評分的預(yù)測值和真實值進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見表7。本實驗相關(guān)系數(shù)P＞0.7，說明真實值與預(yù)測值強(qiáng)相關(guān)，即真實值接近預(yù)測值，CCD-RSM 能準(zhǔn)確預(yù)測黃連解毒湯矯味伴侶劑的配方。

表7 真實值與預(yù)測值的Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果Table 7 Pearson correlation analysis results between experimental and predicted values

3 結(jié)語

篩選優(yōu)化伴侶劑處方實驗中發(fā)現(xiàn)，紐甜的用量越大，矯味效果越好。但大量使用紐甜會導(dǎo)致以下問題：首先，在矯味的同時，引入強(qiáng)烈的甜膩味，增加了入口刺激性，反而影響口感；其次，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，人工甜味劑（紐甜）可以對鼠腸道菌群產(chǎn)生不良影響。在一定范圍內(nèi)，γ-CD 的掩味效果隨其用量的增加而增強(qiáng)，但存在拐點，當(dāng)用量增至1.6%后，掩味效果隨其用量增加的變化不顯著。表明γ-CD 的掩味效果有一定的局限性，特別是單獨使用針對苦味強(qiáng)烈的中藥時。同時，當(dāng)γ-CD 的用量高于3.0%時，會引入特殊的甜味。mPEG2000-PLLA2000抑苦同樣具有有效使用范圍，用量少時難達(dá)良效，用量多則帶入酸澀味。總之，以上3 種抑苦掩味劑各有優(yōu)缺點。針對黃連解毒湯的抑苦掩味，單獨使用任何一種抑苦掩味劑均難達(dá)良效。

本策略下，雖然紐甜矯味和增甜的貢獻(xiàn)最大，但要對黃連解毒湯抑苦掩味取得顯著效果，還需要與γ-CD、mPEG2000-PLLA2000合用，在達(dá)到3 者抑苦增甜協(xié)同作用（如抑制苦味協(xié)同作用最顯著的為γ-CD 和 mPEG2000-PLLA2000、紐甜和 mPEG2000-PLLA2000）的同時，減弱了單獨使用某一種抑苦掩味劑后黃連解毒湯的刺激性，改善口感。總之，紐甜、γ-CD 和mPEG2000-PLLA2000合用，效果并非簡單的疊加，而是三者協(xié)同起效、增加其抑苦掩味和增甜之效，實現(xiàn)1＋1＋1＞3 的效果，避免了大量單獨使用某一種矯味劑引入的不良風(fēng)味和不良反應(yīng)。

本文針對中藥湯劑的苦感為復(fù)雜相態(tài)下（包括真溶液、膠體、乳濁液和混懸液等）眾多成分（多含有生物堿、黃酮、糖苷、苦味素和萜類等苦味成分）與苦味受體之間復(fù)雜的多對多時空響應(yīng)與綜合疊加效應(yīng)的結(jié)果，單一的抑苦掩味手段難以達(dá)到預(yù)期效果。基于其苦味成分“集團(tuán)軍式作戰(zhàn)”形成苦味信號的特點，借鑒霰彈槍發(fā)彈多、打擊面廣、命中率高的實踐經(jīng)驗，引入“霰彈理論”，有機(jī)整合現(xiàn)有掩味（CD 包合）、矯味（甜味劑）和兩親性嵌段聚合物“隱形修飾”苦味成分而抑苦的多種手段。

從藥的角度，聚合物影響相態(tài)組成、降低真溶液中苦味成分分布，γ-CD 包合真溶液中的苦味物質(zhì)、隔離苦味基團(tuán)與受體接觸，阻止苦味信號的形成，對苦味物質(zhì)進(jìn)行層層防護(hù)；而“漏網(wǎng)之苦”則從人的角度，以矯味劑紐甜與苦味物質(zhì)競爭性結(jié)合苦味傳導(dǎo)通路中G 蛋白偶聯(lián)受體，干擾苦味信號的形成和傳導(dǎo)，實現(xiàn)多靶點、多層次和多角度的抑苦掩味，進(jìn)而達(dá)到強(qiáng)效矯味的效果。

宏觀上，實現(xiàn)了從人和藥2 個終極角度（層次）的矯味；微觀上，從湯劑相態(tài)到苦味成分再到苦味信號傳導(dǎo)等不同層面揭示了矯味伴侶劑的作用機(jī)制。綜上所述，本文基于“霰彈理論”，從多靶點、多角度和多層面對中藥液體制劑進(jìn)行了矯味，形成了中藥液體制劑矯味新策略，為解決中藥液體制劑患者服用順應(yīng)性差提供了新的思路和方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突