α-葡萄糖苷酶抑制作用導向分離翻白草活性成分

高 冰，蘇艷芳，張 杰，馬雪姣，王 瑋

天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072

翻白草Potenlilla discolorBge.是薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬PotentillaL.多年生草本植物，主要分布在我國東北、華北及四川等地[1]。《中國藥典》2020年版記載，翻白草性甘、微苦，具有清熱解毒、止痢、止血的功效[2]。近現代醫學藥理研究表明，翻白草有降血糖、保護胰島β 細胞、增強胰島素抵抗等作用，臨床上常用翻白草來治療糖尿病[3]。該植物中的化學成分主要包括黃酮類、萜類、甾體類和有機酸類等類型[2]，但其降血糖成分尚不十分明確，為更好地開發利用這一藥用資源，尋找具有降血糖活性的天然化合物，本研究首先對翻白草的乙醇水提取物進行了α-葡萄糖苷酶抑制活性實驗，發現其具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。進一步分離獲得的二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇萃取物經D101 大孔吸附樹脂洗脫的30%乙醇水洗脫部分也顯示出很強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，故對以上3個提取部位進行深入的化學成分研究，共得到了17個化合物，分別鑒定為3,3′,4,4′-四羥基聯苯（3,3′,4,4′-tetrahydroxybiphenyl，1）、反式銀椴苷（trans- tiliroside，2）、順式銀椴苷（cis-tiliroside，3）、柚皮素-5-O-β-葡萄糖苷（ naringenin 5-O-β- glucoside，4）、異杞柳苷（isosalipurposide，5）、黑色五味子單體苷（schizandriside，6）、紫椴苷B（tiliamuroside B，7）、(?)-異落葉松脂素-9′-O-β-D-吡喃木糖苷 [(?)-isolariciresinol-9'-O-β-D- xylopyranoside，8]、2-羰基-坡模酸（2-oxo-pomolic acid，9）、齊墩果酸（oleanolic acid，10）、熊果酸（ursolic acid，11）、2α,3α,19α-三羥基-12-烯-28-熊果酸（2α,3α,19α- trihydroxy-12-ursen-28-oic acid，12）、2α-羥基齊墩果酸（2α-hydroxy-oleanolic acid，13）、覆盆子酸（fupenzic acid，14）、山柰酚（kaempferol，15）、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（kaempferol-3-O-β-D-glucuronide，16）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸-6′′-甲酯（quercetin-3-O-β-D-glucuronide-6′′-methyl ester，17）。其中，化合物1、3～8 均為首次從委陵菜屬植物中分離得到，化合物9～17 均對α-葡萄糖苷酶有抑制作用。

1 儀器與材料

Autopol Ⅱ型旋光儀（美國魯道夫公司）；XT4A顯微熔點測定儀（北京科儀電光儀器廠）；Bruker Tensor 27 紅外光譜儀（瑞士Bruker 公司）；Bruker Avance III 核磁共振譜儀（600 MHz，瑞士Bruker 公司）；Agilent TOF LC/MS 質譜儀（美國Agilent 公司）；Quiksep 高效液相色譜儀（北京慧德易科技有限責任公司）；ODS 柱色譜硅膠（20～45 μm，Fuji Silysia 化學有限公司產品）；D101 大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司）；薄層色譜硅膠（GF254，10～40 μm）和柱色譜硅膠（100～200、200～300目，青島海洋化工廠）；聚酰胺（60～80 目，浙江臺州路橋四甲生化塑料廠）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（Amersham Pharmacia 生物技術公司）；ZORBAXSB-C18制備柱（250 mm×21.2 mm，7 μm）、ZorbaxSB-C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國安捷倫公司；4-硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷（PNPG，上海泰坦科技股份有限公司）、α-葡萄糖苷酶（北京伊諾凱科技有限公司）。

翻白草于2015年8月采集于安徽霍縣，經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為翻白草P.discolorBge.。標本（編號201508001）收藏于天津大學藥物科學與技術學院。

2 提取與分離

翻白草干燥全草（19.0 kg）在室溫下用95%乙醇浸泡2 周，然后分別用95%乙醇和60%乙醇回流2 次，每次2 h。減壓回收溶劑得到浸膏6.3 kg。醇提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性實驗結果表明其具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，加入2 L 蒸餾水混懸后依次用等體積石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇進行萃取，得到石油醚萃取部分（PDP，334.0 g）、二氯甲烷萃取部分（PDC，290.0 g）、醋酸乙酯萃取部分（PDE，128.0 g）和正丁醇萃取部分（PDB，588.5 g）。正丁醇萃取部分經D101 大孔吸附樹脂吸附，以乙醇-水（0∶100→30∶70→50∶50→95∶5）梯度洗脫，得到水洗脫部分（PDB-H2O，345.5 g），30%乙醇水洗脫部分（PDB30，93.0 g），50%乙醇水洗脫部分（PDB50，22.5 g）和95%乙醇水洗脫部分（PDB95，9.0 g）。根據翻白草的粗提物及不同萃取部分的α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選結果，PDC、PDE、PDB30 部分顯示強的抑制活性，其半數抑制濃度（IC50）值分別為10.0、1.0、2.0 μg/mL，故對PDC、PDE、PDB30 部分的化學成分進行系統研究。

PDC 部分經硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯（8∶2→6∶4→3∶7→0∶100）梯度洗脫，得到4 個流分（Fr.A1～A4），Fr.A2 經多次硅膠及反相ODS 柱色譜分離，得到化合物9（50.0 mg）、10（30.0 mg）、11（50.0 mg）、14（30.5 mg）；Fr.A4 經硅膠柱色譜分離得到3 個流分Fr.A4a～A4c，Fr.A4a 經硅膠柱色譜后用甲醇重結晶，上清液部分經聚酰胺柱色譜分離得到化合物15（10.5 mg），Fr.A4c 經多次硅膠柱色譜后，再經RP-HPLC 分離得到化合物12（15.0 mg）和13（8.2 mg）。PDE 部分經硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯-甲醇（8∶2∶0→6∶4∶0→3∶7∶0→0∶100∶0→0∶98∶2→0∶9∶1→0∶6∶4）梯度洗脫后得到5 個流分（Fr.B1～B5），Fr.B1 經硅膠柱分離得到2 個流分Fr.B1a、B1b，Fr.B1a 經聚酰胺柱色譜，再經RP-HPLC 分離得到化合物1（5.0 mg）；Fr.B3 經硅膠柱色譜后得到5 個流分Fr.B3a～B3e，Fr.B3d 經反復硅膠柱色譜得到3 個流分Fr.B3d1～B3d3, Fr.B3d1 經聚酰胺柱色譜分離得到化合物4（30.0 mg），Fr.B3d2 經RP-HPLC 分離得到化合物5（10.0 mg）；Fr.B4 經硅膠柱色譜及反相HPLC 分離得到化合物2（30.0 mg）和3（3.0 mg）；Fr.B5 經硅膠柱色譜后用甲醇重結晶，上清液經硅膠柱色譜分離得到2 個流分Fr.B5a、B5b, Fr.B5a 用甲醇重結晶得到化合物6（20.0 mg），Fr.B5b 經聚酰胺柱色譜、RP-HPLC 分離得到化合物7（20.0 mg）和8（5.0 mg）。PDB30 部分經硅膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（94∶6→9∶1→8∶2→3∶7→0∶1）梯度洗脫得到3 個流分Fr.C1～C3，Fr.C2 經多次硅膠柱色譜分離得到化合物16（38.0 mg）和17（12.2 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：白色固體（甲醇）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 6.95 (2H, d,J= 2.1 Hz, H-2, 2′), 6.84 (2H, dd,J= 8.2, 2.1 Hz, H-6, 6′), 6.77 (2H, d,J= 8.2 Hz, H-5, 5′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 146.4 (C-4, 4′), 145.3 (C-3, 3′), 134.8 (C-1, 1′), 118.9 (C-6, 6′), 116.5 (C-5, 5′), 114.6 (C-2, 2′)。以上數據與文獻報道一致[4]，故鑒定化合物1 為3,3′,4,4′-四羥基聯苯。

化合物2：黃色固體（甲醇）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 7.99 (2H, brd,J= 8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.81 (2H, brd,J= 8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.31 (1H, brs, H-8), 6.13 (1H, brs, H-6), 5.25 (1H, d,J= 7.4 Hz, glc-H-1′′), 6.07 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8′′′), 6.79 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-3′′′, 5′′′), 7.40 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-7′′′), 7.30 (2H, brd,J= 8.6 Hz, H-2′′′, 6′′′), 4.30 (1H, dd,J= 11.8, 2.1 Hz, H-6′′a), 4.19 (1H, dd,J= 11.8, 6.7 Hz, H-6′′b), 3.43～3.48 (3H, overlapped, H-2′′, 3′′, 5′′), 3.34 (1H, overlapped, H-4′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 158.4 (C-2), 135.2 (C-3), 179.5 (C-4), 163.0 (C-5), 100.0 (C-6), 159.5 (C-7), 94.8 (C-8), 165.9 (C-9), 105.6 (C-10), 122.7 (C-1′), 132.2 (C-2′,6′), 116.8 (C-3′,5′), 161.5 (C-4′), 103.9 (C-1′′), 75.8 (C-2′′), 78.0 (C-3′′), 71.7 (C-4′′), 75.7 (C-5′′), 64.3 (C-6′′), 127.1 (C-1′′′), 131.2 (C-2′′′, 6′′′), 116.8 (C-3′′′, 5′′′), 162.2 (C-4′′′), 146.6 (C-7′′′), 114.7 (C-8′′′), 168.8 (C-9′′′)。以上數據與文獻報道一致[5]，故鑒定化合物2 為反式銀椴苷。

化合物3：黃色固體（甲醇）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 7.96 (2H, brd,J= 8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.82 (2H, brd,J= 8.8 Hz, H-3′, 5′), 6.31 (1H, brs, H-8), 6.19 (1H, brs, H-6), 5.20 (1H, d,J= 7.6 Hz, glc H-1′′), 5.50 (1H, d,J= 12.8 Hz, H-8′′′), 6.68 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′′′, 5′′′), 6.69 (1H, d,J= 12.8 Hz, H-7′′′), 7.51 (2H, brd,J= 8.6 Hz, H-2′′′, 6′′′), 4.19 (2H, overlapped, H-6′′), 3.39～3.46 (3H, overlapped, H-2′′, 3′′, 5′′), 3.27 (1H, overlapped, H-4′′)。以上數據與化合物2 的氫譜對比，僅對羥基桂皮酰基部分的化學位移和偶合常數變化較大，提示化合物2 中為順式對羥基桂皮酰基，結合文獻報道[5]，鑒定化合物3為順式銀椴苷。

化合物4：白色針狀晶體（甲醇）；1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.31 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2′, 6′), 6.78 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3′, 5′), 7.39 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6), 6.07 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-8), 5.37 (1H, dd, J=13.1, 2.0 Hz, H-2), 3.06 (1H, dd,J=17.1, 13.3 Hz, H-3b), 2.61 (1H, dd,J=17.1, 2.8 Hz, H-3a), 4.70 (1H, d,J= 7.1 Hz, H-1′′), 3.28～3.29 (3H, overlapped, H-2′′, 3′′, 5′′), 3.19 (1H, m, H-4′′), 3.73 (1H, d,J=11.5 Hz, H-6′′a), 3.52 (1H, m, H-6′′b)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 80.2 (C-2), 46.3 (C-3), 193.1 (C-4), 162.4 (C-5), 100.4 (C-6), 167.2 (C-7), 99.5 (C-8), 166.6 (C-9), 107.0 (C-10), 131.0 (C-1′), 128.2 (C-2′), 116.3 (C-3′), 159.0 (C-4′), 116.3 (C-5′), 128.2 (C-6′), 105.0 (C-1′′), 74.7 (C-2′′), 77.2 (C-3′′), 71.2 (C-4′′), 78.7 (C-5′), 62.5 (C-6′)。以上數據與文獻報道一致[6]，故鑒定化合物4 為柚皮素-5-O-β-葡萄糖苷。

化合物5：黃色固體（甲醇）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 7.61 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-2,6), 6.83 (2H, d,J= 8.8 Hz, H-3,5), 7.67 (1H, d,J= 15.3 Hz, H-7), 8.03 (1H, d,J= 15.3 Hz, H-8), 5.98 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-3′), 6.21 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-5′), 5.14 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-1′′), 3.92 (1H, dd,J= 12.0, 1.9 Hz, H-6′′a), 3.74 (1H, dd,J= 12.1, 5.2 Hz, H-6′′b), 3.55 (1H, m, H-2′′), 3.50 (1H, m, H-4′′), 3.47 (1H, m, H-5′′), 3.44 (1H, m, H-3′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 128.5 (C-1), 131.8 (C-2, 6), 116.9 (C-3, 5), 161.1 (C-4), 144.2 (C-7), 125.9 (C-8), 194.5 (C-9), 107.4 (C-1′), 161.9 (C-2′), 98.4 (C-3′), 166.0 (C-4′), 95.7 (C-5′), 167.9 (C-6′), 101.9 (C-1′′), 75.0 (C-2′′), 71.1 (C-3′′), 78.5 (C-4′′), 78.5 (C-5′′), 62.4 (C-6′′)。以上數據與文獻報道一致[7]，故鑒定化合物5 為異杞柳苷。

化合物6：白色固體（甲醇）；[α]20D＋33.3° (c0.15, MeOH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 6.16 (1H, s, H-3), 6.64 (1H, s, H-6), 2.81 (2H, m, H-7), 2.07 (1H, m, H-8), 3.76 (1H, dd,J= 10.9, 3.5 Hz, H-9a), 3.70 (1H, dd,J= 10.9, 6.1 Hz, H-9b), 6.77 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-2′), 6.73 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5′), 6.62 (1H, dd,J= 8.0, 1.8 Hz, H-6′), 4.06 (1H, brd,J= 11.1 Hz, H-7′), 1.84 (1H, m, H-8′), 3.20 (1H, m, H-9′a), 3.97 (1H, dd,J= 9.9, 2.6 Hz, H-9′b), 3.80 (3H, s, 3-OMe), 3.79 (3H, s, 3′-OMe), 4.04 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-1′′), 3.20 (1H, m, H-2′′), 3.27 (1H, t,J= 8.9 Hz, H-3′′), 3.45 (1H, m, H-4′′), 3.10 (1H, dd,J= 11.4, 10.7 Hz, H-5′′a), 3.79 (1H, overlapped, H-5′′b)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 127.0 (C-1), 132.6 (C-2), 116.2 (C-3), 144.0 (C-4), 145.4 (C-5), 111.7 (C-6), 32.5 (C-7), 37.5 (C-8), 62.6 (C-9), 136.9 (C-1′), 113.8 (C-2′), 147.1 (C-3′), 144.4 (C-4′), 115.4 (C-5′), 121.1 (C-6′), 45.6 (C-7′), 44.0 (C-8′), 67.2 (C-9′), 104.5 (C-1′′), 73.3 (C-2′), 76.5 (C-3′′), 69.5 (C-4′), 65.6 (C-5′), 55.5 (3-OMe), 55.4 (3′-OMe)。以上數據與文獻報道一致[8]，故鑒定化合物6 為黑色五味子單體苷。

化合物7：白色固體（甲醇）；[α]20D?183.3° (c0.18, MeOH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 6.33 (1H, s, H-3), 6.70 (1H, s, H-6), 2.68 (1H, dd,J= 16.8, 10.9 Hz, H-7a), 2.92 (1H, dd,J= 16.8, 5.7 Hz, H-7b), 1.99 (1H, m, H-8), 3.53 (1H, dd,J= 10.9, 5.0 Hz, H-9a), 3.57 (1H, dd,J= 11.1, 4.7 Hz, H-9b), 6.83 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-2′), 6.61 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5′), 6.32 (1H, dd,J= 8.2, 1.7 Hz, H-6′), 4.26 (1H, brd,J= 4.7 Hz, H-7′), 2.25 (1H, m, H-8′), 3.48 (1H, m, H-9′a), 3.68 (1H, t,J= 9.2 Hz, H-9′b), 3.83 (3H, s, 5-OMe), 3.79 (3H, s, 3′-OMe), 4.22 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-1′′), 3.26 (1H, dd,J= 8.9, 7.5 Hz, H-2′′), 3.31 (1H, overlapped, H-3′′), 3.84 (1H, m, H-4′′), 3.18 (1H, dd,J= 11.2, 10.7 Hz, H-5′′a), 3.84 (1H, overlapped, H-5′′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 127.1 (C-1), 131.8 (C-2), 115.7 (C-3), 144.2 (C-4), 146.4 (C-5), 110.9 (C-6), 31.9 (C-7), 33.6 (C-8), 63.7 (C-9), 134.2 (C-1′), 114.1 (C-2′), 146.7 (C-3′), 144.1 (C-4′), 113.9 (C-5′), 122.7 (C-6′), 45.0 (C-7′), 40.9 (C-8′), 69.9 (C-9′), 104.0 (C-1′′), 73.9 (C-2′′), 76.6 (C-3′′), 69.9 (C-4′′), 65.6 (C-5′′), 54.9 (5-OMe), 54.8 (3′-OMe)。以上數據與文獻報道一致[9]，故鑒定化合物7 為紫椴苷B。

化合物8：白色固體（甲醇）；[α]20D?72.7° (c0.15, MeOH)；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 6.17 (1H, s, H-5), 6.64 (1H, s, H-6), 2.76 (1H, dd,J= 15.8, 4.4 Hz, H-7a), 2.87 (1H, dd,J= 15.6, 11.6 Hz, H-7b), 1.99 (1H, m, H-8), 3.77 (2H, m, H-9), 6.71 (1H, brs, H-2′), 6.73 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5′), 6.58 (1H, dd,J= 8.1, 1.3 Hz, H-6′), 3.80 (1H, overlapped, H-7′), 1.90 (1H, m, H-8′), 3.60 (1H, dd,J= 2.1, 10.3 Hz, H-9′a), 3.71 (1H, m, H-9′b), 3.80 (3H, s, 3-OMe), 3.79 (3H, s, 3′-OMe), 3.99 (1H, d,J=7.7 Hz, H-1′′), 3.15 (1H, t,J= 8.2 Hz, H-2′′), 3.23 (1H, t,J= 9.0 Hz, H-3′′), 3.71 (1H, overlapped, H-4′′), 3.02 (1H, t,J= 11.1 Hz, H-5′′a), 3.44 (1H, m, H-5′′b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 129.2 (C-1), 133.8 (C-2), 117.4 (C-3), 146.0 (C-4), 148.9 (C-5), 112.3 (C-6), 33.8 (C-7), 40.6 (C-8), 65.4 (C-9), 138.7 (C-1′), 114.1 (C-2′), 147.3 (C-3′), 145.2 (C-4′), 116.0 (C-5′), 123.2 (C-6′), 48.5 (C-7′), 45.6 (C-8′), 70.2 (C-9′), 104.7 (C-1′′), 74.9 (C-2′′), 78.0 (C-3′′), 71.2 (C-4′′), 67.0 (C-5′′), 56.3 (3-OMe), 56.3 (3′-OMe)。以上數據與文獻報道一致[10]，故鑒定化合物8 為(?)-異落葉松脂素-9′-O-β-D-吡喃木糖苷。

化合物9：白色固體（二氯甲烷）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 0.72 (3H, s, H-24), 0.80 (3H, s, H-26), 0.89 (3H, s, H-25), 0.93 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-30), 1.18 (3H, s, H-23), 1.19 (3H, s, H-29), 1.40 (3H, s, H-27), 4.00 (1H, s, H-3), 5.30 (1H, t,J= 3.5 Hz, H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 55.1 (C-1), 212.7 (C-2), 83.9 (C-3), 44.6 (C-4), 55.8 (C-5), 19.9 (C-6), 33.8 (C-7), 42.8 (C-8), 46.6 (C-9), 43.1 (C-10), 24.6 (C-11), 128.8 (C-12), 140.2 (C-13), 42.8 (C-14), 29.7 (C-15), 26.6 (C-16), 48.3 (C-17), 54.4 (C-18), 73.6 (C-19), 41.5 (C-20), 27.1 (C-21), 39.0 (C-22), 29.6 (C-23), 17.2 (C-24), 16.6 (C-25), 17.1 (C-26), 24.7 (C-27), 182.3 (C-28), 27.3 (C-29), 16.7 (C-30)。以上數據與文獻報道一致[11]，故鑒定化合物9 為2-羰基-坡模酸。

化合物10：白色顆粒狀固體（二氯甲烷）；1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 0.67 (3H, s, H-23), 0.71 (3H, s, H-24), 0.85 (3H, s, H-25), 0.87 (6H, s, H-26, 29), 0.89 (3H, s, H-30), 1.09 (3H, s, H-27), 4.28 (1H, brs, H-3), 5.24 (1H, t,J= 3.5 Hz, H-12)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 38.1 (C-1), 26.9 (C-2), 76.8 (C-3), 38.4 (C-4), 54.8 (C-5), 18.0 (C-6), 32.4 (C-7), 38.8 (C-8), 47.1 (C-9), 36.6 (C-10), 22.9 (C-11), 121.4 (C-12), 143.9 (C-13), 41.3 (C-14), 27.2 (C-15), 23.4 (C-16), 45.7 (C-17), 40.8 (C-18), 45.7 (C-19), 30.4 (C-20), 33.4 (C-21), 32.1 (C-22), 28.2 (C-23), 16.0 (C-24), 15.1 (C-25), 16.9 (C-26), 25.6 (C-27), 178.8 (C-28), 32.8 (C-29), 22.6 (C-30)。以上數據與文獻報道一致[12]，故鑒定化合物10 為齊墩果酸。

化合物11：白色固體（二氯甲烷）；1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 0.90 (3H, s, H-23), 0.68 (3H, s, H-24), 0.87 (3H, s, H-25), 0.75 (3H, s, H-26), 1.04 (3H, s, H-27), 0.81(3H, d,J= 6.4 Hz, H-29), 0.92 (3H, overlapped, H-30), 5.13 (1H, t,J= 3.3 Hz, H-12), 2.11 (1H, t,J= 11.4 Hz, H-18)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 38.3 (C-1), 28.2 (C-2), 76.8 (C-3), 38.5 (C-4), 54.8 (C-5), 18.0 (C-6), 32.7 (C-7), 40.0 (C-8), 47.0 (C-9), 36.5 (C-10), 23.2 (C-11), 124.5 (C-12), 138.2 (C-13), 41.6 (C-14), 27.5 (C-15), 27.0 (C-16), 46.8 (C-17), 52.4 (C-18), 38.4 (C-19), 38.2 (C-20), 30.2 (C-21), 36.3 (C-22), 21.0 (C-23), 17.0 (C-24), 15.2 (C-25), 16.0 (C-26), 23.8 (C-27), 178.2 (C-28), 16.9 (C-29), 22.8 (C-30)。以上數據與文獻報道一致[13]，故鑒定化合物11 為熊果酸。

化合物12：白色固體（二氯甲烷）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 0.79 (3H, s, H-23), 0.87 (3H, s, H-24), 0.93 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-30), 0.99 (6H, s, H-25, 26), 1.20 (3H, s, H-29), 1.35 (3H, s, H-27), 2.50 (1H, s, H-18), 3.33 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-3), 3.93 (1H, m, H-2), 5.30 (1H, brs, H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 42.5 (C-1), 67.2 (C-2), 80.1 (C-3), 41.3 (C-4), 49.4 (C-5), 19.3 (C-6), 34.1 (C-7), 39.5 (C-8), 48.6 (C-9), 39.4 (C-10), 27.3 (C-11), 129.4 (C-12), 140.1 (C-13), 42.8 (C-14), 29.6 (C-15), 26.6 (C-16), 48.2 (C-17), 55.1 (C-18), 73.6 (C-19), 43.1 (C-20), 24.7 (C-21), 39.1 (C-22), 29.3 (C-23), 22.5 (C-24), 17.6 (C-25), 16.6 (C-26), 27.1 (C-27), 182.4 (C-28), 16.9 (C-29), 24.9 (C-30)。以上數據與文獻報道一致[14]，故鑒定化合物12 為2α,3α,19α-三羥基-12-烯-28-熊果酸。

化合物13：白色固體（二氯甲烷）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 0.81 (3H, s, H-29), 0.82 (3H, s, H-26), 0.91 (3H, s, H-25), 0.94 (3H, s, H-30), 1.00 (3H, s, H-24), 1.01 (3H, s, H-27), 1.17 (3H, s, H-23), 2.86 (1H, dd,J= 13.5, 3.9 Hz, H-18), 2.90 (1H, d,J= 9.8 Hz, H-3), 3.62 (1H, m, H-2), 5.30 (1H, t,J= 3.4 Hz, H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 48.5 (C-1), 69.5 (C-2), 84.5 (C-3), 40.6 (C-4), 56.7 (C-5), 19.6 (C-6), 33.6 (C-7), 40.5 (C-8), 48.2 (C-9), 39.3 (C-10), 24.0 (C-11), 123.4 (C-12), 145.4 (C-13), 42.8 (C-14), 28.8 (C-15), 24.6 (C-16), 47.7 (C-17), 43.0 (C-18), 47.3 (C-19), 31.6 (C-20), 34.9 (C-21), 33.9 (C-22), 29.3 (C-23), 17.8 (C-24), 17.1 (C-25), 17.5 (C-26), 26.4 (C-27), 182.0 (C-28), 33.9 (C-29), 24.1 (C-30)。以上數據與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物13 為2α-羥基齊墩果酸。

化合物14：白色固體（二氯甲烷）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 0.88 (3H, s, H-24), 1.11 (3H, s, H-26), 0.93 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-30), 1.19 (3H, s, H-25), 1.21 (3H, s, H-23), 1.23 (3H, s, H-29), 1.35 (3H, s, H-27), 5.35 (1H, t,J= 3.4 Hz, H-12), 6.29 (1H, s, H-1)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 130.0 (C-1), 146.0 (C-2), 202.4 (C-3), 45.5 (C-4), 55.3 (C-5), 20.3 (C-6), 34.0 (C-7), 39.5 (C-8), 44.1 (C-9), 43.1 (C-10), 24.7 (C-11), 130.2 (C-12), 140.5 (C-13), 43.0 (C-14), 29.6 (C-15), 26.8 (C-16), 48.8 (C-17), 55.1 (C-18), 73.5 (C-19), 41.7 (C-20), 2.1 (C-21), 39.0 (C-22), 28.1 (C-23), 22.3 (C-24), 20.1 (C-25), 17.9 (C-26), 24.7 (C-27), 182.4 (C-28), 27.3 (C-29), 16.6 (C-30)。以上數據與文獻報道一致[16]，故鑒定化合物14 為覆盆子酸。

化合物15：黃色固體（甲醇）；1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 8.08 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3′, 5′), 6.38 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-8), 6.17 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-6)。以上數據與文獻報道一致[17]，故鑒定化合物15 為山柰酚。

化合物16：黃色固體（二氯甲烷）；1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.03 (2H, d,J= 9.0 Hz, H-2′, 6′), 6.86 (2H, d,J= 8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.39 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-8), 6.16 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-6), 5.47 (1H, d,J= 7.4 Hz, glc-H-1′′) ；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6)δ: 156.3 (C-2), 133.1 (C-3), 177.2 (C-4), 161.0 (C-5), 98.8 (C-6), 164.4 (C-7), 93.7 (C-8), 156.3 (C-9), 103.8 (C-10), 120.6 (C-1′), 130.9 (C-2′, 6′), 115.1 (C-3′, 5′), 160.1 (C-4′), 101.1 (C-1′′), 75.3 (C-2′′), 76.0 (C-3′′), 71.7 (C-4′′), 73.8 (C-5′′), 171.2 (C-6′′)。以上數據與文獻報道一致[18]，故鑒定化合物16 為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。

化合物17：黃色固體（甲醇）；1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6)δ: 7.58 (1H, s, H-2′), 7.58 (1H, overlapped, H-6′), 6.84 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5′), 6.37 (1H, d,J= 1.9 Hz, H-8), 6.18 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6), 5.23 (1H, d,J= 7.7 Hz, glc-H-1′′), 3.77 (1H, d,J= 9.8 Hz, H-5′′), 3.65 (3H, s, 6′′-OMe), 3.57 (1H, t,J= 9.2 Hz, H-2′′), 3.52 (1H, dd,J= 9.1, 7.8 Hz, H-4′′), 3.47 (1H, t,J= 9.1 Hz, H-3′′)。以上數據與文獻報道一致[19]，故鑒定化合物17 為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸-6′′-甲酯。

4 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

按文獻方法[20]，以4-硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷（PNPG）為底物測定翻白草乙醇提取物、乙醇提取物的不同萃取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，根據篩選試驗結果對具有明顯抑制活性的二氯甲烷（PDC）、醋酸乙酯（PDE）、正丁醇（PDB30）等萃取物經D101 大孔吸附樹脂分離的30%乙醇水洗脫部分進行了化學成分研究，并對分離得到的化合物及前期本課題組在PDB30 部分分離得到的鞣花酸（18）和5 個木脂素類化合物包括翻白草木脂素A（19）、翻白草木脂素B（20）、(7R,8S)-4,7,9,3′,9′-五羥基-3-甲氧基-8,4′-氧新木脂素-3′-O-β-D-葡萄糖苷（21）、(7S,8R)-4,7,9,3′,9′-五羥基-3-甲氧基-8,4′-氧新木脂素-3′-O-β-D-葡萄糖苷（22）、(7S,8S)-4,7,9,3′,9′-五羥基-3-甲氧基-8,4′-氧新木脂素-3′-O-β-D-葡萄糖苷（23）[21]進行了α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選實驗（表 1），陽性對照為阿卡波糖，陰性對照為DMSO-PBS 緩沖溶液。取50 μL 樣品與50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（0.25 U/mL）充分混合后在37 ℃下孵育10 min，之后加入50 μL PNPG（4 mmol/L）再次在37 ℃下孵育30 min，最后加入200 μL Na2CO3溶液（0.2 mol/L）終止反應。接著取200 μL 的混合物至96 孔板中，使用酶標儀測量每孔在405 nm 下的吸光度值，計算化合物的IC50值。每組樣品設置3 組平行，取其平均值。結果表明，化合物9～17對α-葡萄糖苷酶有抑制作用。

表 1 翻白草中化合物的 α-葡萄糖苷酶抑制活性 (± s , n=3)Table 1 α-Glucosidase inhibitory activities of compounds isolated from P.discolor ( ± s , n=3)

表 1 翻白草中化合物的 α-葡萄糖苷酶抑制活性 (± s , n=3)Table 1 α-Glucosidase inhibitory activities of compounds isolated from P.discolor ( ± s , n=3)

化合物 IC50/(μmol·L?1) 化合物 IC50/(μmol·L?1) 2 ＞250 16 28.6±0.7 6 ＞250 17 23.7±1.3 9 88.5±1.1 18 9.0±0.1 10 12.0±0.6 19 102.2±0.4 11 5.9±0.3 20 202.3±1.2 12 103.1±1.1 21 174.8±1.0 13 7.2±0.8 22 211.0±0.2 14 17.5±0.8 23 229.4±0.7 15 3.3±0.5 阿卡波糖 768.0±1.1

5 討論

本實驗采用多種色譜技術，從翻白草中分離得到了17 個化合物，主要包括三萜類、黃酮類和木脂素等類化合物，其中7 個化合物包括1、3～8 為首次從委陵菜屬植物中分離得到。α-葡萄糖苷酶抑制活性測試結果表明，鞣花酸及多種三萜類、黃酮類和木脂素類化合物均對α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用。研究結果表明鞣花酸、三萜類、黃酮類、木脂素類成分可能是翻白草降血糖作用的藥效物質基礎，為闡明翻白草的降血糖作用，以及尋找具有降血糖活性的植物提取物或活性成分提供了科學依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突