共載HBx-siRNA與五味子油陽離子脂質體納米粒的制備及其對乙型肝炎體外藥效學研究

王 銳，李婭蘭，李建月，楊 婧

1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040

2.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江 哈爾濱 150040

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒誘發的以肝臟病變為主的傳染性疾病。由世界衛生組織統計報道全球慢性乙肝病毒患者約有2.57 億，且88.7 萬人因感染乙肝病毒而死亡，中國乙肝病毒患者約9300 萬例，其中慢性乙型肝炎病患約2000 萬例[1-2]。小干擾RNA（siRNA）技術廣泛應用于乙肝病毒的治療。但裸siRNA 生物半衰期短，容易被胞漿、血液和組織中的酶類降解，生物利用度低。細胞膜表面帶有負電荷，且siRNA 是帶有負電荷的親水性物質，因此，siRNA 進入細胞需要載體介導。北五味子具備護肝的功能，目前對于木脂素的研究較為廣泛，對于北五味子油的研究較少，牛莉萍[3]研究發現北五味子油可通過增加HepG2 細胞內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量而達到使HepG2 細胞凋亡的功能。脂質體作為一種非病毒載體具有無傳染性、無載體容量制約、化學結構可操控，無致瘤危險和抗原性[4-7]。siRNA 為水溶性物質，利用陽離子脂質體可同時裝載水溶性物質和脂溶性物質的特點，選取具有保肝作用的北五味子提取物五味子油[8-9]，將兩者同時裝載于陽離子脂質體內，探究五味子油是否可協同乙型肝炎型小干擾RNA（HBx-siRNA），以達到更好的抑制乙肝病毒的功效。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

OSB-2200旋轉蒸發儀，日本EYELA 株式會社；超聲細胞破碎儀，美國SONICS公司；SYNERGY H1酶聯免疫檢測儀，美國伯騰儀器有限公司；JEM-2100 透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；U-CTR30-2 熒光倒置顯微鏡，德國徠卡公司；粒徑電位儀，北京普析通用儀器有限責任公司；CFX ConnectTM熒光定量PCRA 儀，美國BIO-RAD 公司；DW-86L386 ?80 ℃低溫冰箱，美國Thermo 公司；生物分光光度計、離心機，Eppendorf 公司；渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 藥品與試劑

五味子油，江西森海植物油有限公司，批號20181022，檢測報告：橙黃色透明油狀液體，氣清香，相對密度0.972 0～0.992 0，折光率1.492 0～1.568 0，酸值≤20 mg KOH/g，砷鹽≤0.2 μg/kg，重金屬≤0.001 mg/kg，亞油酸≥10%，五味子甲素≥2.0%。(2,3-二油氧基-丙基)三甲基氯乙銨（N-[1-(2,3- dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride，DOTAP），上海斯信生物有限公司，批號RD-01173；氯仿、異丙醇、無水乙醇，天津市永大化學試劑有限公司；膽固醇，國藥集團化學試劑有限公司，批號20130618；透明質酸（批號H02N8J47121）、魚精蛋白（批號Z31O8H47046）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇 2000（DSPE-PEG2000，批號P31M8S32960），上海源葉生物科技有限公司；siRNA（序列見表1）、熒光標記的siRNA（FAM- siRNA），蘇州吉瑪基因股份有限公司；經焦碳酸二乙酯處理過的高溫消毒的水（DEPC），北京博奧拓達科技有限公司，批號PM11649；二甲基亞砜，上海索萊寶生物科技有限公司，批號D8418；MEM培養基，HyClone 公司，批號AE27142269；胰酶細胞消化液，碧云天生物技術有限公司，批號C0201；無菌PBS，北京博奧拓達科技有限公司，批號180523；胎牛血清，賽澳美細胞技術有限公司，批號20180522；雙抗，美國Gibco 公司，批號J150038；MTT，賽國生物科技有限公司，批號EZ3455C328。

表1 siRNA 序列Table 1 siRNA sequence

1.3 細胞株與培養基

1.3.1 細胞株 HepG2.2.15 表達HBV 病毒的人肝細胞，購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.3.2 培養基 α-MEM＋10% FBS＋1%雙抗＋1%丙酮酸鈉，在37 ℃，5% CO2條件下進行培養。

2 方法與結果

2.1 共載HBx-siRNA 和五味子油陽離子脂質體納米粒的制備

稱量DOTAP 和膽固醇放置到圓底燒瓶內，量取適量的CHCl3溶解。置于旋轉蒸發儀上除去CHCl3，待燒瓶內壁形成一層脂質體薄膜即可。加入適量的0.1% DEPC 水溶液洗下薄膜。超聲處理30 min，加入五味子油，細胞破碎儀下超聲60 s，再緩慢多次通過0.45 μm 濾膜，即得五味子油陽離子脂質體[10]。

量取處方量0.1% DEPC 水溶液，充分震搖使HBx-siRNA 溶解均勻。將siRAN 溶液與等體積的透明質酸混合，震蕩均勻，加入適量的魚精蛋白，充分混合配制好的載五味子油的陽離子脂質體，加入適量的DSPE-PEG2000，即制成共載HBx-siRNA與五味子油陽離子脂質體納米粒。

2.2 單因素實驗優化脂質體納米粒制備工藝

2.2.1 膜材比對包封率的影響 膜材比為陽離子脂質體的成膜成分DOTAP 與膽固醇的質量比，選擇藥脂比1∶5、超聲時間50 min、旋蒸溫度30 ℃，使得膜材比為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質體，考察包封率的變化，結果包封率分別為（64.45±0.28）%、（73.42±0.65）%、（79.54±0.44）%、（75.40±0.34）%、（70.38±0.46）%（n＝3）。膜材比為4∶1、3∶1、2∶1 時脂質體的包封率較高，故選取4∶1、3∶1、2∶1 為膜材比的3 個水平，進行后續考察。

2.2.2 藥脂比對包封率的影響 選擇膜材比3∶1、超聲時間50 min、旋蒸溫度30 ℃，制備五味子油與脂質體的質量比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 時，按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質體，考察脂質體包封率的變化，結果包封率分別為（69.54±0.32）%、（75.32±0.45）%、（89.56± 0.44）%、（91.12±0.43）%、（93.32±0.28）% （n＝3）。脂質體與五味子油的質量比越大，五味子油陽離子脂質體的包封率越大；反之，質量比越小，包封率越小。綜合考慮載藥量以及包封率，選擇1∶4、1∶5、1∶6 為藥脂比的3 個水平。

2.2.3 超聲時間對包封率的影響 選擇膜材比3∶1、藥脂比1∶5、旋蒸溫度30 ℃，改變超聲時間分別為40、50、60、70、80 min，按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質體，結果包封率分別為（75.82±0.48）%、（80.93±0.25）%、（86.44±0.44）%、（83.72±0.56）%、（81.22±0.37）%（n＝3）。超聲時間為50、60、70 min 時脂質體的包封率較高，故選擇50、60、70 min 為超聲時間3 水平。

2.2.4 旋蒸溫度對包封率的影響 固定膜材比3∶1、藥脂比1∶5、超聲時間50 min，改變旋蒸溫度分別為20、30、40、50、60 ℃，按照“2.1”項下方法制備五味子油陽離子脂質體，結果包封率分別為（81.32±0.47）%、（83.66±0.48）%、（83.12±0.72）%、（82.52±0.32）%、（80.47±0.43）% （n＝3）。旋蒸溫度為20、30、40 ℃時包封率較高，在30 ℃時包封率最高，因此，選取30 ℃為最優溫度（相比于其他單因素條件，旋蒸溫度影響包封率的范圍很小，故不必進一步優化）。

2.3 星點設計-效應面法優化五味子油陽離子脂質體處方工藝

2.3.1 實驗設計與結果 根據單因素實驗分析得出，改變旋蒸溫度，得到的相鄰包封率差值較小，故旋蒸溫度對五味子油陽離子脂質體的包封率影響不大，因此，以單因素考察實驗為依據，設定膜材比（X1）、藥脂比（X2）、超聲時間（X3）為考察因素，以五味子油包封率（Y）為評價指標，每個因素設置5 水平。分別用代碼?α、?1、0、+1、+α 表示，對于3 因素的星點設計，α＝1.682。實驗因素與水平安排及結果見表2。

2.3.2 模型擬合 通過Design Expert 8.0 軟件分別對各因素的各水平進行二次多項式方程擬合。并根據方程通過Design Expert 8.0 軟件繪出三維效應面和二維等高線，選取較優組合。二次多項式方程擬合結果為Y＝?597.656 36＋51.565 46X1＋59.731 83X2＋12.217 04X3－3.058 24X1X2＋0.440 88X1X3＋0.787 36X2X3－11.404 24X12－10.239 24X22－ 0.121 49X32，P＜0.05，R2＝0.876 5，回歸方程關系顯著，符合要求。方差結果分析見表3。

結果分析，Y模型項P＜0.05，證明所得回歸方程效果顯著。在Y模型方程中，X3、X2X3、X12、X22、X32都是顯著項，是Y的顯著影響因素。使用Statistica 6.0 軟件處理后得到二維等高線及三維效應面圖，確定最優方案為膜材比為3∶1，藥脂比為1∶5，超聲時間為70 min。結果見圖1。

2.3.3 最佳工藝 采用薄膜分散法，稱取DOTAP和膽固醇的質量比為3∶1，圓底燒瓶中加入適量的三氯甲烷，30 ℃旋蒸成薄膜，真空干燥2 h 后超聲處理30 min，稱取五味子油與脂質體的比為1∶5，超聲70 min，取凍存的HBx-siRAN，4000 r/min 離心1 min，加入0.1% DEPC 溶解。取含有25 μg H B x-s i R A N 的溶液加入等質量的透明質酸（hyaluronic acid，HA）溶液混合形成HA-siRNA。

以HA-siRNA 與PRTM 的質量比為1∶1 進行均勻混合，得到HA-siRNA-PRTM 復合物。在該復合物中加入50 μL 的載五味子油脂質體，10 min 后加入50 μL DSPE-PEG2000，在50 ℃水浴鍋中靜置10 min。共載HBx-siRAN 與五味子油陽離子脂質體納米粒制備完成。

表2 星點設計-效應面法實驗因素水平安排及結果Table 2 Horizontal arrangement and result of experimental factors in star point design-response surface method

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

圖1 膜材比 (X1)、藥脂比 (X2)、超聲時間 (X3) 對包封率的三維效應面和二維等高線圖Fig.1 Three-dimensional effect surface and two-dimensional contour map of membrane material ratio (X1), drug-lipid ratio (X2) and ultrasonic time (X3) on entrapment efficiency

2.3.4 最佳工藝驗證 按照星點設計-效應面法篩選出最佳的載五味子油脂質體的制備工藝，按照最佳工藝制備測定包封率，并把實測值與預測值對比，計算兩數值之間的誤差，如表4，載五味子油陽離子脂質體包封率的預測值與實測值的相對偏差小于5%，證明該工藝準確可靠，重復性良好，星點設計實驗所建立的數學模型預測性良好。課題組前期研究表明，HA-siRNA 與魚精蛋白最佳質量比為1.0∶1.0 時，復合物為帶有負電荷的較小微粒。復合物HBx-siRNA 的載藥量為25 μg 時，加入包和五味子油陽離子脂質體為50 μL 時，制備工藝最佳。

表4 實測值與預測值比較Table 4 Comparison of measured and predicted values

2.4 脂質體納米粒的表征

2.4.1 電位、粒徑及形態的測定 按照“2.3.3”最佳工藝制備共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒樣品，分別取適量樣品加到比色皿和樣品池內，用電位粒徑儀檢測粒徑和Zeta 電位[11-12]。測得共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒的粒徑為（134.000±0.035）nm，多分散指數（PDI）為0.320±0.022，Zeta 電位為（44.000± 0.027）mV。

2.4.2 透射電鏡觀察脂質體外觀 按照“2.3.3”項下最佳工藝制備共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒樣品，取5 μL 滴加在銅網上，室溫靜置至干燥，將銅網置于TEM 下觀察脂質體的形態。并用TEM 觀察觀察脂質體形態，結果見圖2，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒呈不規則的類圓形。

圖2 脂質體TEM 圖Fig.2 TEM of liposome

2.5 脂質體納米粒包封率的測定

2.5.1 標準曲線的建立 將熒光標記的HBx-siRNA （FAM-HBx-siRAN）溶解在適量的0.1% DEPC 水中制備成FAM-siRNA 儲備溶液。取0.1% DEPC 水將儲備液分別稀釋成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μg/μL 質量濃度梯度的標準溶液。492 nm 波長下，通過酶標儀測定每組吸光度（A）值。得到方程Y＝1 005.4X+119.21，R2＝0.997 4。由方程可知，A值與FAM-HBx-siRNA 質量濃度在0.05～0.30 μg/μL 具有良好的線性關系。

2.5.2 包封率和載藥量的測定 按照最佳工藝制備共載FAM-HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒。取適量的溶液進行離心（4000 r/min），取上清液，在492 nm 條件下，采用多功能酶標儀測定A值，根據標準曲線計算出游離FAM-HBx-siRNA質量濃度（C），計算包封率和載藥量。

檢測結果見表5，共載FAM-HBx-siRNA 與五味子油脂質體納米粒的包封率為（81.37±0.08）%，載藥量為（16.25±0.06）%，證明HBx-siRNA 和五味子油在脂質體中具有較好的包封率和載藥量。

表5 載HBx siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒包封率和載藥量Table 5 Encapsulation rate and drug loading of cationic liposome nanoparticles loaded with HBx siRNA and SCF oil

2.6 共載脂質體納米粒對乙型肝炎病毒體外藥效學研究

2.6.1 MTT 檢測細胞增殖抑制實驗 將HepG 2.2.15 細胞接種于96 孔板內，并使每孔含有細胞懸液100 μL。將96 孔板放入細胞培養箱內放置24 h，至HepG2.2.15 細胞單層平鋪孔底，棄去原培養基。加入制備好的濃度為20、40、60、80、100 nmol/L的共載HBx-siRNA 與五味子油的陽離子脂質體納米粒，選取0 nmol/L 濃度作為對照組，每組設3 個復孔。放入條件為37 ℃、5% CO2培養箱內，放置24、48 h。

同上分別加入載五味子油、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油的陽離子脂質體納米粒α-MEM 基本培養基100 μL。以100 μL 空白陽離子脂質體α-MEM 基本培養基作為對照組，每一組設置3 個復孔。放入條件為37 ℃、5% CO2培養箱內，放置24、48 h。使用酶標儀，檢測各孔A值，并記下各組數據。

如表6 所示，在給藥24 h 后，20、40、60、80、100 nmol/L 濃度的共載HBx-siRNA 與五味子油脂質體納米粒對 HepG2.2.15 細胞抑制率分別是7.97%、20.10%、37.98%、45.73%、54.63%。在給藥48 h 后，20、40、60、80、100 nmol/L 濃度的共載 HBx-siRNA 與五味子油脂質體納米粒對HepG2.2.15 細胞抑制率分別是17.84%、33.33%、56.47%、68.87%、74.38%。說明共載HBx-siRNA與五味子油脂質體納米粒對HepG2.2.15 細胞增殖的抑制具有劑量相關性。通過細胞增殖抑制率計算公式（抑制率＝1－A加藥/A對照），計算得共載HBx- siRNA 與五味子油脂質體納米粒在24、48 h 抑制HepG2.2.15 細胞增殖50%時的藥物濃度（IC50）分別為53.5、107.4 nmol/L。因此，在后續各實驗時共載脂質體納米粒的濃度選定為100 nmol/L。

表6 不同濃度陽離子脂質體納米粒對HepG2.2.15 細胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 6 Inhibition of HepG2.2.15 cell proliferation by cationic liposome nanoparticles with different concentrations ( ± s,n = 3)

表6 不同濃度陽離子脂質體納米粒對HepG2.2.15 細胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 6 Inhibition of HepG2.2.15 cell proliferation by cationic liposome nanoparticles with different concentrations ( ± s,n = 3)

與對照組比較：*P＜0.05，表7～9 同*P ＜ 0.05 vs negative control group, same as table 7—9

濃度/ 24 h 48 h 組別 (nmol·L?1) A 值 抑制率/% A 值 抑制率/% 對照 ? 1.393±0.025 ? 1.452±0.022 ? 共載HBx-siRNA 與 20 1.282±0.031* 7.97 1.193±0.035* 17.84 五味子油陽離子 40 1.113±0.048* 20.10 0.968±0.045* 33.33 脂質體納米粒 60 0.864±0.034* 37.98 0.632±0.027* 56.47 80 0.756±0.051* 45.73 0.452±0.023* 68.87 100 0.632±0.025* 54.63 0.372±0.031* 74.38

如表7 所示，在給藥后24 h 時，載五味子油陽離子脂質體組的抑制率為20.22%，載HBx-siRNA組的抑制率為42.82%，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體組的抑制率為52.78%。在給藥后48 h 時，各組的抑制率明顯增加，載五味子油陽離子脂質體組的抑制率為25.10%，載HBx-siRNA 組的抑制率為59.26%，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體組的抑制率為73.59%。與陰性對照組

表7 陽離子脂質體納米粒對HepG2.2.15 細胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 7 Inhibition of cationic liposome nanoparticles on the proliferation of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)

表7 陽離子脂質體納米粒對HepG2.2.15 細胞增殖的抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 7 Inhibition of cationic liposome nanoparticles on the proliferation of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)

組別 24 h 48 h A 值 抑制率/% A 值 抑制率/% 對照 1.385±0.022 ? 1.458±0.032 ? 載五味子油陽離子脂質體 1.105±0.037* 20.22 1.092±0.043* 25.10 載HBx-siRNA 0.794±0.026* 42.82 0.594±0.027* 59.26 共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體 0.654±0.018* 52.78 0.385±0.028* 73.59

（空白陽離子脂質體組）進行對比，各組都具有統計學意義（P＜0.05）。由實驗數據可知，在相同的給藥時間內，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體組的抑制率大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質體組大于陰性對照組。共載HBx- siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒對HepG 2.2.15 細胞的增殖具有較好的抑制作用。

2.6.2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 給藥組分別加入載五味子油陽離子脂質體、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒含1% FBS 的α-MEM 培養基2 mL。用含有1% FBS 的α-MEM 培養基作為對照。放置到37 ℃、5% CO2培養箱內12、24 h 后觀察細胞劃痕，測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。

結果如圖3 和表8 所示，在12 h 時，陰性對照組、載五味子油陽離子脂質體組、載HBx-siRNA 陽離子脂質體組、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體組的劃痕愈合率分別為（48.5±1.5）%、（17.0±1.8）%、（9.2±2.1）%、（3.6±1.8）%，在24 h 后，陰性對照組的劃痕基本愈合，而其他3 組雖有愈合，但是愈合速度明顯減慢，由以上數據可知，共載HBx- siRNA 與五味子油陽離子脂質體組對HepG2.2.15 細胞遷移能力的抑制作用大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質體組大于陰性對照組。共載HBx-siRNA 與五味子油組陽離子脂質體納米粒具有較好的抑制HepG2.2.15 細胞遷移的能力。

圖3 細胞劃痕實驗Fig.3 Cell scratch experiment

表8 陽離子脂質體納米粒對HepG2.2.15 細胞遷移能力抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 8 Inhibition of cationic liposome nanoparticle on migration of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)

表8 陽離子脂質體納米粒對HepG2.2.15 細胞遷移能力抑制作用 ( ± s, n = 3)Table 8 Inhibition of cationic liposome nanoparticle on migration of HepG2.2.15 cells ( ± s, n = 3)

組別 劃痕愈合率/% 12 h 24 h 對照 48.5±1.5 73.2±2.2 載五味子油陽離子脂質體 17.0±1.8* 26.9±1.9* 載HBx-siRNA 陽離子脂質體 9.2±2.1* 19.5±2.1* 共載HBx-siRNA 與五味子 油陽離子脂質體 3.6±1.8* 15.2±1.8*

2.6.3 細胞攝取實驗 將HepG2.2.15 細胞接種到6孔細胞培養板上，將加入α-MEM 完全培養液作為對照組，給藥組加入載FAM-HBx-siRNA 的陽離子脂質體納米粒的α-MEM 完全培養基。12、24 h 后棄去培養液，加入2 mL 無菌PBS 重復洗滌2 次。熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的攝取效果。

結果如圖4 所示，將載FAM-HBx-siRNA 陽離子脂質體納米粒處理過的HepG2.2.15 細胞，經給藥12、24 h 后，將細胞貼壁面向上，放置在熒光倒置顯微鏡下觀察攝取效果，發現綠色熒光即為攝取了FAM-HBx-siRNA 的細胞。將載FAM-HBx-siRNA組與陰性對照組經處理后，放置顯微鏡下觀察，載FAM-HBx-siRNA 組在給藥12 h 后，出現部分綠色熒光，而對照組無此現象。在給藥24 h 后，載FAM-HBx-siRNA 組綠色熒光數量進一步增加，而陰性對照組仍無此現象。觀察結果顯示，HepG2.2.15細胞對載FAM-HBx-siRNA 陽離子脂質體納米粒的攝取效果顯著。

圖4 HepG2.2.15 細胞攝取FAM-siRNA 陽離子脂質體納米粒效果Fig.4 Uptake effect of FAM-siRNA cationic liposome nanoparticles by HepG2.2.15 cells

2.6.4 ELISA 法檢測HepG2.2.15 細胞上清液中乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝核心抗原（HBeAg）的水平 將HepG2.2.15細胞接種到6孔細胞培養板 上，分別加入載五味子油、載HBx-siRNA、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒α-MEM 培養基2 mL。以加入2 mL α-MEM 基本培養基作為對照組，每組設3 個復孔；放置到培養條件為37 ℃、5% CO2培養箱內，放置48 h；48 h 后收取各組細胞上清液至滅菌后的離心管中，2500 r/min 離心20 min，收集上清。實驗過程參照酶聯生物公司HBeAg 及HBsAg 試劑盒說明書。

結果如表9 所示，在給藥48 h 后，載五味子油陽離子脂質體組、載HBx-siRNA 組、共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體組分別與陰性對照組相比細胞上清液中的HBsAg 和HBeAg 的水平均有下降，并且對于抑制HepG2.2.15 細胞分泌HBsAg和HBeAg 的水平共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體組大于載HBx-siRNA 組大于載五味子油陽離子脂質體組大于陰性對照組，與陰性對照組對比，各組都具有統計學意義（P＜0.05）。由數據可知，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒具有較好的抑制HepG2.2.15 細胞分泌HBsAg和HBeAg 的作用。

表9 陽離子脂質體對 HBsAg 和 HBeAg 水平的影響 ( ± s, n = 3)Table 9 Effects of cationic liposomes on HBsAg and HBeAg levels ( ± s, n = 3)

表9 陽離子脂質體對 HBsAg 和 HBeAg 水平的影響 ( ± s, n = 3)Table 9 Effects of cationic liposomes on HBsAg and HBeAg levels ( ± s, n = 3)

組別 A 值 HBsAg HBeAg 對照 2.358±0.148 1.832±0.058 載五味子油陽離子脂質體 2.015±0.132* 1.694±0.055* 載HBx-siRNA 1.325±0.125* 1.028±0.053* 共載HBx-siRNA 與五味子 油陽離子脂質體 0.645±0.108* 0.452±0.051*

3 討論

慢性乙型肝炎是危害全球人民健康的嚴峻問題，每年有好幾十萬人都因為感染HBV 導致肝功能衰竭、肝硬化和肝癌而死亡[13-14]。陽離子脂質體目前在醫藥界基因療法研發中較為常用，與細胞膜在電荷效應下具有較強的親和力，利于其進到細胞內進行藥物運輸[15-16]。薄膜分散法是常用的制備脂質體的工藝，此方法不僅制備工藝簡單，還可以得到較高的包封率[17]。但是薄膜分散法所得到的脂質體粒徑較大且不穩定，本實驗通過適當增加超聲時間使脂質體粒徑變小且均勻穩定，通過單因素考察和星點設計-效應面法，優化五味子油陽離子脂質體的制備工藝條件，由數據可知，經過工藝優化制出的共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒具有較好的包封率、粒徑和Zeta 電位，并且形狀良好。

MTT 作用機制是可使活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶還原成不溶于水的藍色結晶-甲臜，死細胞不能發生此反應，而DMSO 可以溶解甲臜，經酶標儀測定的A值可以體現出活細胞的多少[18-19]。本實驗表明，共載HBx-siRNA 與五味子油組抑制HepG 2.2.15 細胞增殖的效果最強，具有較好的抑制 HepG2.2.15 細胞增殖的作用。

通過細胞劃痕實驗可以考察出藥物對細胞遷移能力的影響[20]。本研究發現共載HBx-siRNA 與五味子油組具有較好的抑制 HepG2.2.15 細胞遷移能力。HepG2.2.15 細胞對共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體的攝取是產生其抑制乙型肝炎效果的重要指標，實驗表明，HepG2.2.15 細胞對載FAM-HBx-siRNA 的陽離子脂質體納米粒的攝取效果顯著。

HBeAg 與HBsAg 的含量是檢測是否感染乙型肝炎的重要指標，目前慣用的測定HBeAg和HBsAg的方法是ELISA 實驗。常用雙抗原夾心法可簡單、方便、敏感度較高的快速檢測到HepG2.2.15 細胞上清液中分泌的HBeAg 和HBsAg[21-22]。本研究發現，共載HBx-siRNA 與五味子油陽離子脂質體納米粒有較好的抑制HepG 2.2.15 細胞分泌HBeAg 和HBsAg 的作用。綜上所述，五味子油協同HBx- siRNA 具有較好的抑制乙型肝炎的效果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突