pH響應三氧化二砷聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒的制備及體外評價

吳仁杰，余紅芳，顏星星，范 婷，諸佳珍，謝曉偉，施 政*，姚文棟*

1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院 藥劑科，浙江 杭州 310018

2.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 311400

砒霜在我國擁有悠久的應用歷史，其主要成分為三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）。20 世紀70年代，黑龍江中醫藥大學將ATO 用于急性早幼粒細胞白血病的治療，并取得了顯著的療效[1]。隨著ATO的使用，經研究發現其對于肝癌、乳腺癌等多種實體瘤也存在抑制生長和誘導凋亡的作用[2-3]。ATO能夠影響細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖與轉移，還能夠通過影響線粒體功能誘導腫瘤細胞凋亡[3]。但ATO 進入人體后，血漿結合率高，代謝消除快，無特異性分布等缺陷導致的諸多不良反應限制了其對于實體瘤的臨床應用[4]。因此，通過相關生物學及制劑技術提高ATO 在體內的穩定性，延長作用時間，使其具有靶向性、腫瘤環境響應給藥特性[5]，這對ATO 應用于腫瘤的治療具有重要意義。

乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glyconlic acid，PLGA）由乳酸和羥基乙酸縮合而成，被人體吸收后可正常代謝，對生物體無毒副作用，是美國食品藥品監督管理局（ Food and Drug Administration，FDA）批準的可安全使用的藥用高分子材料[6]。PLGA 具有良好的生物相容性和可降解性，形成納米?；蛭⑶蚝罂蓱糜谒幬锏陌窈奢d，提高包載藥物體內穩定性[7]。PLGA 納米粒具備靶向性及緩控釋特性，使包載藥物特異性分布且延長其作用時間[8-9]。并且，PLGA 可經修飾或添加針對腫瘤微環境刺激性響應因子，如NaHCO3，而制備成pH 響應PLGA 納米粒（pH-PLGA）[10]。

PLGA 納米粒的上述特性使之成為ATO的理想載體。因此，本研究以NaHCO3為pH 響應因子制備了pH 響應的載三氧化二砷PLGA 納米粒（pH- ATO-PLGA＠NPs），并對其粒徑、多分散系數（PDI）、穩定性、體外釋放及對人源性肝癌HepG2細胞的毒性進行考察。

1 儀器與材料

Nano-ZS 90 激光粒度分析儀，英國Malvern 儀器有限公司；HT7700 透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司；Optima Max 超速低溫離心機，美國Beckman Coulter 有限公司；JY92-IIN 超聲波粉粹儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；細胞培養箱，美國Thermo 公司；SpectraMax M2 酶標儀，美國Molecular Devices 公司；ICAP 6300 電感耦合等離子發射光譜儀，美國Thermo 公司；R205D 旋轉蒸發儀，上海申勝生物技術有限公司；ZD-85 恒溫水浴震蕩器，力辰科技有限公司。

PLGA，批號93671849，相對分子質量20 000，6∶4，濟南岱罡生物工程有限公司；1,3-雙硬脂酸甘油酯，瑪雅試劑有限公司，批號MAYA-CR-784；二氯甲烷，麥克林試劑，批號C10167809；ATO，蘇州諾德派森公司，批號20151005，質量分數97%；NaHCO3，Aladdin 公司，批號J1916092；砷標準溶液（1 mg/mL，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，貨號GSB04-1714-2004）；胎牛血清，杭州四季青公司，批號18110504；司盤-80，Aladdin 公司，批號38771；聚乙烯醇，美國Sigma Aldrich 公司，批號1002287571，其余試劑均為分析純。HepG2細胞由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。

2 方法與結果

2.1 pH-PLGA 納米粒（pH-PLGA＠NPs）的制備及處方工藝優化

2.1.1 pH-PLGA＠NPs 的制備方法 本研究采用復乳溶劑蒸發法[11]制備納米粒。稱取適量PLGA 溶于10 mL 二氯甲烷，加入1,3-雙硬脂酸甘油酯60 mg及1.0 mL 司盤-80 溶解作為油相；取NaHCO3水溶液作為內水相于離心管，加入油相后于超聲波粉粹儀下超聲15 min。在超聲后所得初乳中加入表面活性劑聚乙烯醇（PVA）的水溶液，再超聲得到復乳。復乳至圓底燒瓶40 ℃水浴旋懸蒸10 min 后，于40 ℃水浴攪拌4 h，揮干有機溶劑，即得pH- PLGA＠NPs。

以pH-PLGA＠NPs 的粒徑及多分散系數（PDI）為指標，考察PLGA 用量、超聲功率、表面活性劑濃度、NaHCO3質量濃度對納米粒的影響。

2.1.2 PLGA 用量 根據“2.1.1”項下所述方法，分別稱取50、100、150、200、250 mg PLGA 溶于10 mL 二氯甲烷，加入1,3-雙硬脂酸甘油酯60 mg及1.0 mL 司盤-80 溶解作為油相，采用180 W 超聲功率，0.2% PVA 溶液，2.5 mg/mL NaHCO3溶液進行后續操作，制備pH-PLGA＠NPs，并分別對所得納米粒的粒徑及PDI 進行檢測，結果見表1。為方便后續載藥及生物學研究[7]，綜合納米粒粒徑及PDI 結果，選取200 mg PLGA 投料量進行納米粒的制備。

表1 不同PLGA 投料量對pH-PLGA＠NPs 粒徑及PDI 的影響 ( ± s, n = 3)Table 1 Effects of PLGA with different dosages on size and PDI of pH-PLGA＠NPs ( ± s, n = 3)

表1 不同PLGA 投料量對pH-PLGA＠NPs 粒徑及PDI 的影響 ( ± s, n = 3)Table 1 Effects of PLGA with different dosages on size and PDI of pH-PLGA＠NPs ( ± s, n = 3)

PLGA/mg 粒徑/nm PDI 50 272.38±8.34 0.42±0.07 100 253.76±4.54 0.36±0.07 150 238.26±3.42 0.27±0.05 200 226.61±2.14 0.22±0.02 250 232.54±4.43 0.24±0.02

2.1.3 超聲功率 根據“2.1.1”項下所述方法，稱取200 mg PLGA 溶于10 mL 二氯甲烷，加入1,3-雙硬脂酸甘油酯60 mg 及1.0 mL 司盤-80 溶解作為油相。選取0、90、180、270、360 W 超聲功率進行超聲，采用0.2% PVA 溶液，2.5 mg/mL NaHCO3溶液并進行后續操作，制備pH-PLGA＠NPs，并分別對所得納米粒的粒徑及PDI 進行檢測，結果見表2。綜合粒徑與PDI 結果，選取180 W 超聲制備pH-PLGA＠NPs。

表2 不同超聲功率對pH-PLGA＠NPs 粒徑及PDI 的影響( ± s, n = 3)Table 2 Effect of different ultrasonic power on size and PDI of pH-PLGA＠NPs ( ± s, n = 3)

表2 不同超聲功率對pH-PLGA＠NPs 粒徑及PDI 的影響( ± s, n = 3)Table 2 Effect of different ultrasonic power on size and PDI of pH-PLGA＠NPs ( ± s, n = 3)

功率/W 粒徑/nm PDI 0 896.55±28.52 0.76±0.08 90 428.82±6.38 0.34±0.04 180 224.39±2.52 0.22±0.02 270 234.38±3.65 0.28±0.02 360 239.43±3.26 0.29±0.03

2.1.4 表面活性劑濃度 分別稱取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 g PVA 水浴加熱溶于100 mL 純水中得0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% PVA 溶液。根據“2.1.1”項下所述方法，稱取200 mg PLGA 溶于10 mL 二氯甲烷，加入1,3-雙硬脂酸甘油酯60 mg及1.0 mL 司盤-80 溶解作為油相，在180 W 下超聲。分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% PVA 溶液，采用2.5 mg/mL NaHCO3溶液并進行后續操作，制備pH-PLGA＠NPs，并分別對所得納米粒的粒徑及PDI 進行檢測，結果見表3。0.2%、0.4%濃度的PVA 溶液所制備的pH-PLGA＠NPs 粒徑無顯著性差異（P＞0.05），但0.4%濃度下的PDI 更小，故而選取0.4%濃度的PVA 溶液作為表面活性劑制備pH-PLGA＠NPs。

表3 不同表面活性劑濃度對pH-PLGA＠NPs 粒徑及PDI的影響 ( ± s, n = 3)Table 3 Effects of different surfactant concentrations on size and PDI of pH-PLGA＠NPs ( ± s, n = 3)

表3 不同表面活性劑濃度對pH-PLGA＠NPs 粒徑及PDI的影響 ( ± s, n = 3)Table 3 Effects of different surfactant concentrations on size and PDI of pH-PLGA＠NPs ( ± s, n = 3)

PVA/% 粒徑/nm PDI 0.2 212.46±2.84 0.25±0.04 0.4 212.35±2.16 0.21±0.02 0.6 243.27±2.49 0.22±0.04 0.8 259.71±5.91 0.26±0.03 1.0 290.65±7.52 0.35±0.07

2.1.5 NaHCO3質量濃度 根據“2.1.1”項下所述方法，稱取200 mg PLGA 溶于10 mL 二氯甲烷，加入1,3-雙硬脂酸甘油酯60 mg 及1.0 mL 司盤-80溶解作為油相，在180 W 下超聲，加入0.4% PVA溶液。內水相分別為1.0（pH 8.39）、2.5（pH 8.39）、5.0（pH 8.40）、7.5（pH 8.42）、10.0（pH 8.44）mg/mL NaHCO3溶液，并進行后續操作，制備pH-PLGA＠ NPs，并分別對所得pH-PLGA＠NPs 的粒徑及PDI進行檢測，結果如表4 所示。綜合粒徑與PDI 結果，選取2.5 mg/mL NaHCO3溶液為內水相制備pH- PLGA＠NPs。

表4 不同NaHCO3 質量濃度對pH-PLGA＠NPs 粒徑及PDI 的影響 ( ± s, n = 3)Table 4 Effects of different NaHCO3 concentrations on size and PDI of pH-PLGA＠NPs ( ± s, n = 3)

表4 不同NaHCO3 質量濃度對pH-PLGA＠NPs 粒徑及PDI 的影響 ( ± s, n = 3)Table 4 Effects of different NaHCO3 concentrations on size and PDI of pH-PLGA＠NPs ( ± s, n = 3)

NaHCO3/(mg·mL?1) 粒徑/nm PDI 1.0 229.48±2.63 0.26±0.03 2.5 210.56±2.32 0.21±0.02 5.0 247.85±3.68 0.29±0.08 7.5 276.42±5.71 0.39±0.12 10.0 435.40±10.22 0.51±0.12

2.1.6 pH-PLGA＠NPs 制備方法優化結果 綜合PLGA 用量、超聲功率、表面活性劑濃度及NaHCO3質量濃度考察結果，得到pH-PLGA＠NPs 最終制備方案：稱取200 mg PLGA 溶于10 mL 二氯甲烷，加入1,3-雙硬脂酸甘油酯60 mg 及1.0 mL 司盤-80溶解作為油相；取2.5 mg/mL NaHCO3溶液0.5 mL作為水相于離心管，加入2.5 mL 油相后于超聲波粉碎儀下以180 W 功率超聲10 min，形成初乳。所得初乳中加入0.4%聚乙烯醇PVA 水溶液8 mL 后，180 W 功率超聲波粉粹儀下超聲10 min，得到復乳。取復乳至圓底燒瓶懸旋蒸10 min 后，于40 ℃水浴攪拌4 h，揮干有機溶劑。將成品于10 000 r/min 高速離心10 min，去上清，減壓干燥得pH-PLGA＠NPs。

2.2 pH-ATO-PLGA、PLGA、ATO-PLGA 納米粒（ pH-ATO-PLGA＠NPs 、 PLGA＠NPs 、 ATO- PLGA＠NPs）的制備

內水相加入0.5 mL 10 mg/mL ATO 溶液，油相按“2.1.6”項下所述方法制備，后續步驟相同。揮干有機溶劑后，將pH-ATO-PLGA＠NPs 的溶液移至透析袋中，在500 mL 外液環境中透析6 h（100 r/min）除去未包載的游離ATO，得到pH-ATO- PLGA＠NPs。制備過程中不加入NaHCO3溶液重復“2.1.6”項后續步驟，得到普通的PLGA＠NPs。無pH 響應的普通PLGA＠NPs，重復“2.1.6”項后續步驟負載ATO，得到ATO-PLGA＠NPs。

2.3 pH-ATO-PLGA＠NPs 的表征

2.3.1 粒徑、Zeta 電位及形態 通過Nano-ZS 90激光粒度分析儀測定PLGA＠NPs、pH-PLGA＠ NPs、ATO-PLGA＠NPs、pH-ATO-PLGA＠NPs 的粒徑、PDI 及Zeta 電位；采用HT7700 透射電子顯微鏡觀察pH-ATO-PLGA＠NPs 的形態。

復乳溶劑蒸發法制備所得PLGA＠NPs、pH- PLGA＠NPs、ATO-PLGA＠NPs 及pH-ATO-PLGA＠ NPs 的粒徑見表5，PLGA＠NPs 的粒徑、PDI 及Zeta電位分別為（206.18±1.83）nm、0.20±0.02、 （?22.26±1.43）mV。載藥后，納米粒的粒徑和PDI均有所增大，變為（212.54±2.04）nm 及0.24±0.03，Zeta 電位下降至（?23.46±1.96）mV。pH 響應因子加入后，pH-PLGA＠NPs 粒徑較PLGA＠NPs 略有增加，Zeta 電位卻顯著下降至（?32.75±1.81）mV。pH-ATO-PLGA＠NPs 兼具載藥及pH 響應功能，粒徑增大至（214.35±1.86）nm，Zeta 電位下降至（?35.49±1.88）mV。

表5 PLGA＠NPs、pH-PLGA＠NPs、ATO-PLGA＠NPs與pH-ATO-PLGA＠NPs 的粒徑、PDI、電位 ( ± s, n = 3)Table 5 Particle size, PDI, Zeta potential of PLGA＠NPs, pH-PLGA＠NPs, ATO-PLGA＠NPs and pH-ATO-PLGA＠ NPs ( ± s, n = 3)

表5 PLGA＠NPs、pH-PLGA＠NPs、ATO-PLGA＠NPs與pH-ATO-PLGA＠NPs 的粒徑、PDI、電位 ( ± s, n = 3)Table 5 Particle size, PDI, Zeta potential of PLGA＠NPs, pH-PLGA＠NPs, ATO-PLGA＠NPs and pH-ATO-PLGA＠ NPs ( ± s, n = 3)

樣品 粒徑/nm PDI Zeta 電位/mV PLGA＠NPs 206.18±1.53 0.20±0.02 ?22.26±1.43 pH-PLGA＠NPs 210.43±1.68 0.21±0.02 ?32.75±1.81 ATO-PLGA＠NPs 212.54±2.04 0.24±0.03 ?23.46±1.96 pH-ATO-PLGA＠NPs 214.35±1.86 0.24±0.02 ?35.49±1.88

TEM 結果（圖1）顯示，pH-ATO-PLGA＠NPs形態規整，呈圓整球形或類球形，分散性良好，無團聚現象，但TEM 下粒徑比粒徑儀測得的小20 nm左右。

圖1 pH-ATO-PLGA＠NPs 的TEM 圖Fig.1 TEM of pH-ATO-PLGA＠NPs

2.3.2 包封率和載藥量 取ATO-PLGA＠NPs 與pH-ATO-PLGA＠NPs 制備過程中透析6 h 后的透析外液，用已建立的電感耦合等離子發射光譜儀測定其砷質量濃度[12]，通過質量濃度及質量分數換算得到游離ATO 的質量，記作W1；將收集得到的納米粒質量，記作Wt；按以下公式分別計算ATO 的包封率和載藥量。

W0為ATO 總投藥量，W1為ATO-PLGA＠NPs 或pH-ATO- PLGA＠NPs 中的游離藥物量，Wt為ATO-PLGA＠NPs 或pH-ATO-PLGA＠NPs 的總質量

通過對透析外液測定結果，計算得到ATO- PLGA＠NPs 的包封率為（68.76±2.92）%，載藥量為（1.84±0.42）%；而pH-ATO-PLGA＠NPs 的包封率為（62.32±2.61）%，載藥量為（1.59±0.34）%，ATO-PLGA＠NPs 的包封率與載藥量均略高于pH-ATO-PLGA＠NPs。

2.3.3 穩定性 將制備好的 PLGA＠NPs、pH- PLGA＠NPs、ATO-PLGA＠NPs 及pH-ATO-PLGA＠ NPs 分散于超純水中，于4 ℃環境放置，分別測定其0、1、3、5、7 d 粒徑及Zeta 電位的變化。

粒徑變化結果見圖2-A，納米粒粒徑均隨著放置時間延長而逐漸減小。到第7 天，PLGA＠NPs下降至（195.31±2.94）nm，粒徑下降了約11 nm；pH-PLGA＠NPs 下降至（192.68±3.02）nm，粒徑下降了約17 nm；ATO-PLGA＠NPs 下降至（197.62±2.64）nm，較初始粒徑下降了約15 nm；pH-ATO- PLGA＠NPs 下降至（187.74±3.14）nm，較初始粒徑下降幅度最大，約為27 nm。

圖2 PLGA＠NPs、pH-PLGA＠NPs、ATO-PLGA＠NPs與pH-ATO-PLGA＠NPs 在4 ℃環境冷藏的穩定性粒徑 (A) 及Zeta 電位 (B) 變化 ( ± s, n = 3)Fig 2 Stability changes in particle size (A) and Zeta potential (B) of PLGA＠NPs, pH-PLGA＠NPs, ATO- PLGA＠NPs and pH-ATO-PLGA＠NPs in cold storage at 4 ℃ ( ± s, n = 3)

電位變化結果見圖2-B，納米粒電位均隨著放置時間延長而逐漸減小。到第7 天，PLGA＠NPs電位下降至（?27.41±1.89）mV，下降幅度最?。籶H-PLGA＠NPs 電位下降至（?44.92±1.98）mV，較初始電位下降了約12 mV；ATO-PLGA＠NPs 電位下降至（?35.22±2.63）mV，較初始電位下降了約 10 mV；pH-ATO-PLGA＠NPs 電位下降至 （?59.58±1.39）mV，較初始電位下降了約23 mV，下降幅度最大。

結果表明，加入pH 響應因子及載藥后，納米粒的穩定性較PLGA＠NPs 略有下降。

2.4 體外釋放

采用透析袋法測定ATO、ATO-PLGA＠NPs 與pH-ATO-PLGA＠NPs 的體外釋藥特性。精密稱取ATO、ATO-PLGA＠NPs 和pH-ATO-PLGA＠NPs 并適量分散溶解后，分別取2 mL（含ATO 2 mg）置于透析袋中，密封后分別放入pH 值分別為7.4、6.5、5.5 的500 mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）為釋放介質的燒杯中，然后置于37 ℃、100 r/min 恒溫水浴震蕩器中，避光，平行操作3 份。于0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 時間點吸取1.0 mL 的透析液，并補充同溫等量釋放介質。樣品用0.22 μm 微孔濾膜濾過后，續濾液測定砷質量濃度，換算并計算累積釋放率，結果見圖3。

圖3 ATO、ATO-PLGA＠NPs 及pH-ATO-PLGA＠NPs 在pH 7.4 (A)、6.5 (B)、5.5 (C) 環境中的體外釋放曲線 ( ± s, n = 3)Fig.3 In vitro release curves of ATO, ATO-PLGA＠NPs and pH-ATO-PLGA＠NPs in pH 7.4 (A), 6.5 (B), 5.5 (C) ( ± s, n = 3)

ATO 為水溶性藥物，盡管有透析袋減緩其釋放速率，2 h 時在3 種不同pH 值的PBS 中均釋放超過90%，且在之后基本釋放完全，釋放曲線趨于平緩。經ATO-PLGA＠NPs 包埋后，ATO 的釋放速率明顯降低，24 h 在pH 7.4、6.5、5.5 環境中累積釋放了（62.81±3.11）%、（60.78±2.96）%、（60.78±2.87）%，具有明顯的緩釋特性，不具備pH 響應特性。pH-ATO-PLGA＠NPs 則具備pH 響應特性。24 h時，pH-ATO-PLGA＠NPs 中ATO 在pH 7.4 PBS 中積累積釋放量接近ATO-PLGA＠NPs，為（67.36±3.24）%；在pH 6.5 PBS 中，累積釋放量已高于ATO- PLGA＠NPs，為（72.42±4.51）%；在pH 5.5 PBS中，pH-ATO-PLGA＠NPs 中ATO 積累積釋放量進一步升高至（89.06±3.92）%，具備pH 響應特性。

2.5 細胞學評價

2.5.1 空白載體細胞毒性 取處于對數生長期的HepG2 細胞，以8×103個/孔接種于96 孔板，37 ℃培養12 h。取上述培養細胞后的96 孔板，移棄培養液，分別加入質量濃度10、25、50、100、250、500、 1000 μg/mL 的PLGA＠NPs 及pH-PLGA＠NPs 的無血清培養基繼續培養24 h 后，吸去含藥培養液，每孔加入0.2 mL 含0.5 mg/mL MTT 的PBS，于37 ℃繼續孵育4 h，吸去含有MTT 的培養液，用PBS 清洗3 次后，每孔加入0.15 mL DMSO，振搖15 min，溶解均勻后使用酶標檢測儀于波長540 nm 處測定吸收度（A）值。

不同質量濃度的PLGA＠NPs 及pH-PLGA＠ NPs 對HepG2 細胞存活率的影響結果如圖4 所示。在質量濃度10～250 μg/mL 時，PLGA＠NPs 表現出良好的生物相容性，存活率均未受影響；當質量濃度達到500 μg/mL 時，HepG2 細胞雖然受到影響，pH-PLGA＠ NPs 組HepG2 細胞的存活率小于90%，但仍高于85%，而PLGA＠NPs 組的存活率仍大于90%；當質量濃度增大至1000 μg/mL 時，PLGA＠ NPs 與pH-PLGA＠NPs 組HepG2 細胞的存活率均下降至小于80%。上述結果表明，PLGA＠NPs 與pH-PLGA＠NPs 均對HepG2 細胞的細胞毒性作用均較弱，pH-PLGA＠NPs 的細胞毒性作用略高于PLGA＠NPs。

圖 4 不同質量濃度PLGA＠NPs、pH-PLGA＠NPs 對HepG2 細胞存活率的影響 ( ± s, n = 3)Fig.4 Effects of PLGA＠NPs, pH-PLGA＠NPs with different concentrations on survival rate of HepG2 cells ( ± s, n = 3)

2.5.2 載藥納米粒的細胞毒性 為了測定納米粒pH 響應性及對ATO 包載后對腫瘤細胞活性的影響，采用MTT 考察納米粒在pH 7.4、6.5 對HepG2細胞的細胞毒性。取處于對數生長期的HepG2 細胞，以8×103個/孔接種于96 孔板，37 ℃培養12 h。取上述培養細胞后的96 孔板，移棄培養液，分別加入含ATO 濃度為1、5、10、25、50、100 μmol/L的ATO、ATO-PLGA＠NPs 及pH-ATO-PLGA＠NPs的普通無血清培養基（pH 7.4）與酸化后的無血清培養基（pH 6.5）繼續培養24 h。后續操作同“2.5.1”項，測定A值，計算半數抑制濃度（IC50）值。結果見圖5-A、B，在pH 7.4 時，ATO 溶液的細胞毒性大于ATO-PLGA＠NPs 及pH-ATO-PLGA ＠NPs，并計算得到其 IC50為（21.99±1.30）μmol/L；ATO-PLGA＠NPs 的IC50為（26.64±1.06）μmol/L，細胞毒性低于pH-ATO-PLGA＠NPs 的（23.71±0.70）μmol/L（P＜0.05）。而在pH 6.5 時，ATO 溶液的IC50為（21.17±1.72）μmol/L，與pH 7.4 時無顯著性差異（P＞0.05）；而pH-ATO-PLGA＠NPs的IC50與pH 7.4 時相比顯著減?。≒＜0.01），為（16.40±0.62）μmol/L，ATO-PLGA＠NPs 的IC50為（24.36±0.71）μmol/L。

圖 5 不同濃度 ATO、ATO-PLGA＠NPs 及 pH-ATO- PLGA＠NPs 在pH 7.4 (A) 與pH 6.5 (B) 時對HepG2 細胞的毒性 ( ± s, n = 3)Fig.5 Toxicity of ATO, ATO-PLGA＠NPs and pH-ATO- PLGA＠NPs of different concentrations on HepG2 cells at pH 7.4 (A), pH 6.5 (B) ( ± s, n = 3)

圖 6 不同濃度 ATO、ATO-PLGA＠NPs 及 pH-ATO- PLGA＠NPs 在pH 7.4 時對L02 細胞的毒性 ( ± s, n = 3)Fig.6 Toxicity of ATO, ATO-PLGA＠NPs and pH-ATO- PLGA＠NPs of different concentrations on L02 cell at pH 7.4 ( ± s, n = 3)

為了測定pH 響應納米粒包載后對正常細胞活性的影響，采用MTT 考察納米粒在pH 7.4 的L02細胞中的細胞毒性。L02 細胞（pH 7.4）的培養及給藥同HepG2 細胞。結果見圖6，在pH 7.4 的L02細胞中，ATO 溶液的細胞毒性大于ATO-PLGA＠ NPs 及pH-ATO-PLGA＠NPs，其IC50為（28.25±1.33）μmol/L；ATO-PLGA＠NPs 的IC50為（40.83±1.76）μmol/L，細胞毒性顯著低于ATO（P＜0.01）；pH-ATO-PLGA＠NPs 的 IC50為（39.72±1.84）μmol/L，細胞毒性顯著低于ATO（P＜0.01），且與ATO-PLGA＠NPs 無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

ATO 作為砒霜的活性成分，在我國擁有悠久的用藥史?，F代醫學研究發現其不僅對于包括急性早幼粒細胞白血病的血液癌療效極佳，對于肝癌等實體瘤也展現出優越的治療潛力[3,13]。但是ATO 進入人體后，血漿蛋白結合率高[14]，腎清除快，無特異性分布等缺陷影響了對實體瘤治療的效果，且極易對正常組織產生毒副作用[3-4]。納米技術在醫學的應用使藥物具備靶向及緩釋特性，改善了藥物的體內藥動學[15-16]。因此，本實驗采用生物相容性良好的PLGA 為材料制備了納米粒并加入NaHCO3賦予納米粒pH 響應特性[10,17]，改善ATO 的上述缺陷：（1）通過對ATO 的包埋，提高ATO 的穩定性；（2）通過緩釋及對腫瘤環境低pH 的響應減少對正常組織的毒副作用。

本實驗制備的pH-ATO-PLGA＠NPs 在馬爾文粒徑儀中測得粒徑為（214.35±1.86）nm，TEM 下觀察到的粒徑在150～180 nm（電鏡圖中較?。?。其原因為粒徑儀測得為納米粒的水合粒徑，大于電鏡下直接觀察的粒徑[18]。pH-ATO-PLGA＠NPs 因其存在pH 響應因子的NaHCO3，再負載ATO 時離子強度增加，故而使其載藥量、包封率及穩定性均略低于 ATO-PLGA＠NPs[17]。因 pH-ATO-PLGA＠NPs在純水中穩定性較ATO-PLGA＠NPs 低，更適合以減壓干燥或凍干粉末形式保存，在pH-ATO-PLGA＠ NPs 在配置后需盡快使用。

ATO-PLGA＠NPs 與pH-ATO-PLGA＠NPs 包載藥物后具備緩釋特性，但在釋藥最初階段仍然存在輕微突釋現象，這可能是由于：（1）原本黏附在納米粒表面的ATO 經干燥復溶過程而呈游離狀態；（2）干燥復溶過程使納米粒表面存在裂隙，使較為淺表的藥物迅速釋放[19-20]。pH-ATO-PLGA＠NPs 則具備明顯的pH 響應特性，隨pH 值的下降，24 h累積釋放率逐步上升。pH-ATO-PLGA＠NPs 的此特性可以使其到達腫瘤后，響應腫瘤微環境的低pH值，加速釋放ATO。

細胞學評價表明，作為載體的PLGA＠NPs 及pH-PLGA＠NPs 在低濃度及正常給藥的納米粒濃度時，生物相容性良好，極高濃度時才會產生細胞毒性。pH-PLGA＠NPs 的細胞毒性略高于普通的PLGA＠NPs，因pH-PLGA＠NPs 中含有作為pH 響應因子的NaHCO3，NaHCO3濃度隨pH-PLGA＠NPs濃度增加而升高，增強了pH-PLGA＠NPs 的細胞毒性。在pH 7.4 時，ATO-PLGA＠NPs 及pH-ATO- PLGA＠NPs 對HepG2 的細胞毒性均小于ATO 溶液，這是由于：（1）ATO 本身可通過自由擴散進入細胞，PLGA＠NPs 及pH-PLGA＠NPs 包埋后需要細胞內吞進入細胞，入胞方式的改變使細胞攝入ATO 量減少[21-22]；（2）PLGA＠NPs 及pH-PLGA＠ NPs 包埋后ATO 呈緩釋狀態，使得在起初階段大部分ATO 未釋放完全[23]。

pH-ATO-PLGA＠NPs 的細胞毒性高于ATO- PLGA＠NPs，主要原因為細胞攝取進入溶酶體后，因pH-ATO-PLGA＠NPs 的pH 響應較ATO-PLGA＠ NPs 釋放相對較快、較完全[24]。雖然pH 值為7.4時，ATO-PLGA＠NPs 及pH-ATO-PLGA＠NPs 對肝癌細胞的毒性小于ATO（P＜0.05），但pH 值為6.5時（腫瘤微環境pH）[25]，pH-ATO-PLGA＠NPs 的細胞毒性大于ATO（P＜0.05）。這是因為：（1）pH- ATO-PLGA＠NPs 的pH 響應性使其未入胞部分也釋放了ATO，可以入胞；（2）pH-ATO-PLGA＠NPs釋放ATO 的同時，也釋放了NaHCO3，溶酶體內的滲透壓上升快，使溶酶體加速破裂；（3）pH-ATO- PLGA＠NPs 及已釋放的ATO 釋放到細胞質中，接觸作用靶點，與上升的滲透壓共同作用加速細胞凋亡[26-28]。pH-ATO-PLGA＠NPs 不僅具備pH 響應特性，并通過pH 響應特性實現了對ATO 釋放的調控從而改變了ATO 在腫瘤細胞中的細胞毒性。

而在人正常肝細胞L02 中，ATO-PLGA＠NPs及pH-ATO-PLGA＠NPs 的細胞毒性均顯著低于ATO 溶液（P＜0.01）。這表明制備成納米制劑后，由于納米粒的緩釋及正常細胞對納米粒的胞吞作用小于代謝較快的腫瘤細胞，pH-ATO-PLGA＠NPs 對正常細胞的毒性降低[29]。并且，進入人體后，納米粒可改善ATO 原有缺陷并通過靶向性，增加ATO在瘤分布，從而提高療效。pH-ATO-PLGA＠NPs 的pH 響應特性使得其可以在腫瘤微環境加速釋放，較ATO-PLGA＠NPs 進一步提高療效。在后繼的研究中此外，研究者后續將對其在體內藥動學參數及是否可以有效增加荷瘤動物的體內抗腫瘤作用加以探究。

綜上所述，pH-ATO-PLGA＠NPs 可有效改善ATO 在治療實體瘤方面代謝消除快，無特異性分布等缺陷，使ATO 具備靶向、緩釋及pH 響應特性，為ATO 有效應用于實體瘤的治療奠定基礎。本實驗的設計及展開為諸如ATO 的半衰期短、治療窗窄、無特異性分布的有毒類中藥新型納米制劑的構建研究提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突