難溶性中藥成分在過(guò)飽和體系下晶體成核和生長(zhǎng)行為研究

歐陽(yáng)料淇，蔣且英，陳緒龍，趙國(guó)巍，丁海波，劉 歡，廖正根*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004

2.江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，江西 南昌 330004

許多中藥中的有效成分是難溶性成分，難溶會(huì)導(dǎo)致口服生物利用度低，提高難溶性藥物的溶解度/溶出性能一直是藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)。在眾多的增溶技術(shù)中，無(wú)定形化是提高溶解度/溶出性能的重要手段[1-3]，然而，無(wú)定形藥物在制備、貯存和溶出的過(guò)程中容易發(fā)生重結(jié)晶而導(dǎo)致溶出性能發(fā)生改變[4]。為了提高無(wú)定形藥物的物理穩(wěn)定性，通常需要加入輔料以制備成固體分散體。固體分散體的物理穩(wěn)定性既受分子與載體的相互作用的影響，也與藥物本身的晶體成核和生長(zhǎng)等結(jié)晶趨勢(shì)有關(guān)。研究藥物的晶體成核和生長(zhǎng)性能從而了解藥物的結(jié)晶趨勢(shì)對(duì)無(wú)定形固體分散體的處方設(shè)計(jì)具有重要意義[5]。

穿心蓮內(nèi)酯、延胡索乙素、水飛薊賓、丹皮酚、姜黃素與銀杏內(nèi)酯B 6 種化合物均是具有重要藥理活作用的中藥活性成分，除姜黃素外均有制劑上市，這些化合物為難溶性化合物，制成口服固體制劑時(shí)需要改善溶解度/溶出度，而研究這些藥物的晶體成核和生長(zhǎng)等結(jié)晶行為對(duì)其無(wú)定形制劑的處方設(shè)計(jì)有良好的指導(dǎo)作用，但其晶體成核和生長(zhǎng)性能尚未見(jiàn)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)開(kāi)展難溶性中藥成分在過(guò)飽和體系下晶體成核和生長(zhǎng)行為的研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；BAS124S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；85-2A 雙數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；Oxford-diffraction X 射線單晶衍射儀，日本Rigaku 公司；UV-2550 紫外分光光度計(jì)，島津-GL 消耗品銷售有限公司；Diamond DSC 型差示掃描量熱分析儀，美國(guó)Perkin Elmer 公司；明美Mshot MS60 偏振光顯微鏡，廣州市明美光電技術(shù)有限公司。

1.2 材料

穿心蓮內(nèi)酯（批號(hào)CXLNZ20181230，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、延胡索乙素（批號(hào)YHS20191209，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、延胡索乙素對(duì)照品（批號(hào)110726- 200610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、水飛薊賓（批號(hào)HXSFJB 20190305，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、丹皮酚（批號(hào)DPF 20200326，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)HX200908132，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、姜黃素（批號(hào)JHS20180328，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%），西安昊軒生物科技有限公司；穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)5508-58-7，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、水飛薊賓對(duì)照品（批號(hào)S-0240181008，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、姜黃素對(duì)照品（批號(hào)AF7111708，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、銀杏內(nèi)酯B 對(duì)照品（批號(hào)AF9061206，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%），成都埃法生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），批號(hào)2007282，西隴科學(xué)股份有限公司；水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

穿心蓮內(nèi)酯[6]、延胡索乙素[7]、水飛薊賓[8]、丹皮酚[9]、姜黃素[10]、銀杏內(nèi)酯B[11]6 種成分的含量測(cè)定分別按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行，6 種成分的回歸方程分別為Y＝42.311X－13.190，R2＝0.999 9，線性范圍9.99～199.80 μg/mL；Y＝4 935.2X－2.084 1，R2＝0.999 9，線性范圍4.99～99.80 μg/mL；Y＝26 815X－30.476，R2＝0.999 8，線性范圍4.80～240.06 μg/mL；Y＝24 553X－4.173 7，R2＝0.999 8，線性范圍 2.01～101.00 μg/mL；Y＝77.739X－24.702，R2＝0.999 9，線性范圍1.14～45.52 μg/mL；Y＝506.72X－3 409.5，R2＝0.999 8，線性范圍10.01～1 000.00 μg/mL。

2.2 平衡溶解度測(cè)定

將過(guò)量的原料藥加入2% DMSO 中，37 ℃恒溫?fù)u床平衡24 h[12]，濾過(guò)，續(xù)濾液用甲醇稀釋適宜倍數(shù)后，HPLC 法測(cè)定平衡溶解度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 藥物在2% DMSO 中的平衡溶解度 ( ± s, n = 3)Table 1 Equilibrium solubility of drugs in 2% DMSO ( ± s, n = 3)

表1 藥物在2% DMSO 中的平衡溶解度 ( ± s, n = 3)Table 1 Equilibrium solubility of drugs in 2% DMSO ( ± s, n = 3)

藥物 平衡溶解度/ (μg·mL?1) 藥物 平衡溶解度/ (μg·mL?1) 穿心蓮內(nèi)酯 85.65±1.50 丹皮酚 883.41±11.54 延胡索乙素 45.24±1.53 姜黃素 0.16±0.00 水飛薊賓 1.54±0.00 銀杏內(nèi)酯B 200.23±1.58

2.3 過(guò)飽和度（S）的確定

根據(jù)基于溶液狀態(tài)下的成核和晶體生長(zhǎng)行為建立的結(jié)晶分類方法[13]，采用S分別為5、20 的過(guò)飽和體系，研究6 種成分的結(jié)晶行為[14]。S按下式計(jì)算[15-16]。

S＝C/C*

C*為藥物在含2% DMSO 的水中測(cè)定的平衡質(zhì)量濃度，C為根據(jù)所需的過(guò)飽和水平配制的藥物DMSO 溶液加入水中后計(jì)算的理論質(zhì)量濃度

2.4 成核時(shí)間的測(cè)定

根據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法，取一定量的穿心蓮內(nèi)酯、延胡索乙素、水飛薊賓、丹皮酚、姜黃素、銀杏內(nèi)酯B 溶于DMSO 中，再將其轉(zhuǎn)移到水中，分別配制成S為5、20 的溶液，使用紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量溶液在非吸收波長(zhǎng)（λ＝500 nm）的光散射隨時(shí)間的變化，每隔20 s 測(cè)量1 次吸光度（A）值，持續(xù)1 h。繪制吸光度-時(shí)間曲線，A值隨時(shí)間變化的曲線由2 個(gè)不同的線性區(qū)域組成（圖1），2 個(gè)區(qū)域繪制的回歸線的交點(diǎn)稱為成核時(shí)間（tind）（另外2個(gè)成分丹皮酚和銀杏內(nèi)酯B 一加入到水中立刻產(chǎn)生沉淀，成核誘導(dǎo)時(shí)間為0，因此沒(méi)有相應(yīng)的圖）。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯、延胡索乙素、水飛薊賓、姜黃素成核誘導(dǎo)時(shí)間的測(cè)定Fig.1 Determination of nucleation induction time of andrographolide, tetrahydropalmatine, silybin, and curcumin

使用Origin Pro 對(duì)A值-時(shí)間曲線分段回歸分析確定的tind見(jiàn)表2，結(jié)果顯示，S＝20 時(shí)，6 種成分在1 h 內(nèi)均觀察到沉淀產(chǎn)生，且延胡索乙素、丹皮酚和銀杏內(nèi)酯B 的DMSO 溶液一轉(zhuǎn)移到水中立刻成核；而S＝5 時(shí)，僅穿心蓮內(nèi)酯、延胡索乙素、丹皮酚、銀杏內(nèi)酯B 在1 h 內(nèi)觀察到沉淀產(chǎn)生，且丹皮酚和銀杏內(nèi)酯B 在S＝5 時(shí)也立刻成核。

表2 在不同過(guò)飽和度條件下藥物的tind ( ± s, n = 3)Table 2 tind of drugs under different supersaturation conditions ( ± s, n = 3)

表2 在不同過(guò)飽和度條件下藥物的tind ( ± s, n = 3)Table 2 tind of drugs under different supersaturation conditions ( ± s, n = 3)

藥物 S tind/s 藥物 S tind/s 藥物 S tind/s 穿心蓮內(nèi)酯 5 191.57±13.55 水飛薊賓 5 ＞3600 姜黃素 5 ＞3600 20 98.38±12.67 20 1 283.24±59.74 20 1 534.03±252.95 延胡索乙素 5 131.43±25.71 丹皮酚 5 0 銀杏內(nèi)酯B 5 0 20 0 20 0 20 0

2.5 晶體生長(zhǎng)速率的測(cè)定

藥物有機(jī)溶液和盛有一定量水的錐形瓶預(yù)先放在（37.0±0.1）℃、100 r/min 的振蕩水浴中預(yù)熱，按S分別為5、20 分別將“2.4”項(xiàng)中的藥物有機(jī)溶液加入到錐形瓶中，混合30 s 后，加入5%藥物量過(guò)60 目篩的原料藥作為晶種，分別在0、10、20、30、45、60、90、120 min 取1 mL 樣品，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)除去結(jié)晶沉淀，適當(dāng)稀釋后，立即使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在λmax處對(duì)樣品進(jìn)行分析。以實(shí)驗(yàn)開(kāi)始30 min 的A值-時(shí)間曲線的斜率作為晶體生長(zhǎng)速率[17]，結(jié)果見(jiàn)表3、4，結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi) 酯和延胡索乙素在2 種過(guò)飽和度下的斜率為負(fù)值，表明發(fā)生了快速晶體生長(zhǎng)，而其余4 種物質(zhì)斜率為正值，表示晶體生長(zhǎng)緩慢。

表3 晶體生長(zhǎng)速率的測(cè)定Table 3 Determination of crystal growth rate

表4 在不同過(guò)飽和度下藥物的晶體生長(zhǎng)速率 (n = 3)Table 4 Crystal growth rate of drugs under different supersaturation (n = 3)

2.6 偏光下沉淀形態(tài)觀察

取“2.4”項(xiàng)下過(guò)飽和度為20、實(shí)驗(yàn)1 h 后的混懸液20 μL，滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于偏振光顯微鏡下觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2，沉淀在偏光下具有明顯雙折射現(xiàn)象，表明產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，這個(gè)結(jié)果與成核實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，且每個(gè)藥物沉淀所表現(xiàn)出來(lái)的形狀和大小因藥物而異。

圖2 藥物在2% DMSO 溶液 (S = 20) 中的結(jié)晶偏光圖Fig.2 Polarization diagram of drug in 2% DMSO solution (S = 20)

2.7 沉淀表征

2.7.1 沉淀處理方法 將晶體生長(zhǎng)研究結(jié)束時(shí)收集的沉淀物置于離心管中，13 000 r/min 離心10 min，傾去上清液后至真空干燥箱，25 ℃，干燥，得沉淀粉末。

2.7.2 差示掃描量熱法（differential scanning calorimeter，DSC） 分別取各原料藥與沉淀粉末適量，置入鋁皿中后放入DSC 樣品爐中，進(jìn)行DSC測(cè)定。升溫速率10 ℃/min，記錄各個(gè)樣品差示掃描量熱曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。穿心蓮內(nèi)酯、延胡索乙素、水飛薊賓、姜黃素沉淀粉末與原料藥相比，晶體吸熱峰位置未見(jiàn)明顯變化。銀杏內(nèi)酯B 原料藥在330.08 ℃有尖銳熔融峰存在，而銀杏內(nèi)酯B 沉淀粉末在348.51 ℃處有明顯的吸熱峰，與銀杏內(nèi)酯B 原料藥相比，沉淀粉末吸熱峰位置發(fā)現(xiàn)明顯位移，表明銀杏內(nèi)酯B 沉淀晶體結(jié)構(gòu)已發(fā)生了明顯變化。丹皮酚原料藥在50.74 ℃有尖銳熔融峰存在；丹皮酚沉淀粉末在45.92 ℃處有明顯的吸熱峰，吸熱峰位置發(fā)現(xiàn)明顯位移，說(shuō)明丹皮酚沉淀晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。DSC 圖譜中，各沉淀粉末沒(méi)有出現(xiàn)脫水峰，說(shuō)明藥物在晶體生長(zhǎng)研究中沒(méi)有形成水合物。

圖3 原料藥與沉淀粉末DSC 圖譜Fig.3 DSC spectrum of API and precipitated powder

2.7.3 X 射線粉末衍射（XRD） 分別取各原料藥， 沉淀粉末適量，置于樣品槽中，壓平，進(jìn)行X 射線衍射分析。測(cè)定條件：Cu-Kα 靶，工作電壓為50 kV，電流為1.0 mA，曝光時(shí)間80 s 掃描2θ角度0°～60°，記錄樣品X 射線衍射曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。穿心蓮內(nèi)酯、延胡索乙素、水飛薊賓、姜黃素沉淀粉末與原料藥相比，衍射峰未見(jiàn)明顯變化，表明其晶型未發(fā)生改變；而丹皮酚沉淀粉末與原料藥相比，26.29°的衍射峰偏移至25.13°且在16.11°出現(xiàn)新的衍射峰，銀杏內(nèi)酯B 沉淀粉末與原料藥相比，8.33°的衍射峰偏移至7.61°且在13.30°，15.29°處出現(xiàn)新的衍射峰，說(shuō)明丹皮酚、銀杏內(nèi)酯B 沉淀晶型發(fā)生了改變，與DSC 圖譜結(jié)果一致。

圖4 原料藥與沉淀粉末XRD 圖譜Fig.4 XRD spectrum of API and precipitated powder

3 討論

由于藥物自身的結(jié)晶趨勢(shì)是影響無(wú)定形固體分散體制備和儲(chǔ)存穩(wěn)定性的重要因素，并與無(wú)定形固體分散體的處方設(shè)計(jì)密切相關(guān)[5]，近年來(lái)有多篇文獻(xiàn)運(yùn)用模擬藥劑學(xué)中產(chǎn)生結(jié)晶過(guò)程的方法研究了藥物的結(jié)晶行為并建立了藥物結(jié)晶趨勢(shì)分類體系，包括模擬構(gòu)建固體分散體的熔融冷卻法[18-19]、溶劑蒸發(fā)法[20]以及模擬體內(nèi)分散行為的反溶劑法[13,21]。考慮到無(wú)論哪種過(guò)飽和體系最終都可能在體內(nèi)分散時(shí)產(chǎn)生結(jié)晶，故本實(shí)驗(yàn)采用反溶劑法研究難溶性中藥活性成分的結(jié)晶行為。

根據(jù)Rathi 等[13]的分類標(biāo)準(zhǔn)，成核時(shí)間小于1 h的藥物為快速成核藥物，大于1 h 則為緩慢成核藥物；晶體生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出負(fù)斜率的藥物歸為快速晶體生長(zhǎng)藥物，表現(xiàn)出正斜率或者為常數(shù)的藥物歸為緩慢晶體生長(zhǎng)藥物。所研究的6 種藥物中，無(wú)論是高過(guò)飽和度（S＝20）還是低過(guò)飽和度（S＝5），穿心蓮內(nèi)酯、延胡索乙素的成核時(shí)間均少于1 h，晶體生長(zhǎng)速率的斜率為負(fù)值，故屬于快速成核-快速晶體生長(zhǎng)類藥物（I 類）；丹皮酚、銀杏內(nèi)酯B 的成核時(shí)間均小于1 h，晶體生長(zhǎng)速率的斜率為正值，故屬于快速成核-緩慢晶體生長(zhǎng)類藥物（II 類）。水飛薊賓、姜黃素在高過(guò)飽和度（S＝20）時(shí)成核時(shí)間小于1 h、低過(guò)飽和度（S＝5）時(shí)的成核時(shí)間大于1 h，但晶體生長(zhǎng)速率的斜率均為正值，故在高過(guò)飽和度（S＝20）屬于快速成核-緩慢晶體生長(zhǎng)（II 類）、低過(guò)飽和度（S＝5）時(shí)屬于緩慢成核-緩慢晶體生長(zhǎng)類藥物（IV 類），這可能是由于這類藥物具有較大的亞穩(wěn)態(tài)寬度[22]。

對(duì)于結(jié)晶趨勢(shì)較大的藥物，一般需要大量的輔料且需要輔料與藥物達(dá)到分子水平的均勻混合才能維持藥物的無(wú)定形狀態(tài)；對(duì)于結(jié)晶趨勢(shì)較低的藥物，即使藥物的量超過(guò)了固體溶解度極限，藥物仍會(huì)保持無(wú)定形狀態(tài)，因此，可以減少輔料用量，以提高 載藥量[5]。穿心蓮內(nèi)酯、延胡索乙素、丹皮酚、銀杏內(nèi)酯B、高過(guò)飽和度下的水飛薊賓、姜黃素屬于I 或II 類等結(jié)晶趨勢(shì)較強(qiáng)的藥物，制備成無(wú)定形固體分散體時(shí)，可能需要加入較多的輔料，并需要輔料與藥物達(dá)到分子水平的混合；而將結(jié)晶趨勢(shì)較低的低過(guò)飽和度的水飛薊賓、姜黃素制備成無(wú)定形固體分散體則可能較易實(shí)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)采用去過(guò)飽和法測(cè)定晶體生長(zhǎng)，即測(cè)定除去沉淀后溶液中各物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度以反映生長(zhǎng)。一般如果成核迅速，許多晶體同時(shí)形成，導(dǎo)致立即去過(guò)飽和而顯示快生長(zhǎng)[13]。本研究中成核時(shí)間測(cè)定的結(jié)果表明丹皮酚和銀杏內(nèi)酯B 為快速成核化合物，但卻顯示為慢生長(zhǎng)，可能是因?yàn)槌珊诉^(guò)快，大量成核后消耗了大量藥物分子使其濃度下降導(dǎo)致生長(zhǎng)速度減慢。由于該2 種物質(zhì)成核速度過(guò)快，可能來(lái)不及形成穩(wěn)定晶型的晶核，觸發(fā)以自身形成的亞穩(wěn)定晶核為基準(zhǔn)的晶體生長(zhǎng)，從而發(fā)生轉(zhuǎn)晶，為了驗(yàn)證這種推測(cè)，故進(jìn)一步采用DSC 和XRD 對(duì)其晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果顯示該2 種物質(zhì)發(fā)生了轉(zhuǎn)晶，從而證實(shí)了推論，也進(jìn)一步證實(shí)了該2 種物質(zhì)為快成核化合物。

藥物結(jié)晶趨勢(shì)與藥物分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，分子量小、苯環(huán)數(shù)較大及雙鍵較多等剛性結(jié)構(gòu)分子、分支較少和高對(duì)稱性的分子易結(jié)晶[23]。本研究中6 種分子均含有相對(duì)較多的苯環(huán)數(shù)（延胡索乙素、水飛薊賓、丹皮酚），或含有較多的苯環(huán)數(shù)和雙鍵（姜黃素），或以環(huán)形結(jié)構(gòu)為主（穿心蓮內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B），均表現(xiàn)為剛性結(jié)構(gòu)，這可能是它們?nèi)菀捉Y(jié)晶的原因。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，選用2% DMSO 作為溶劑體系不影響藥物的結(jié)晶行為[21]，在過(guò)飽和溶液中加入原料藥晶體作為晶種，可以避開(kāi)成核步驟，從而能夠僅測(cè)量晶體生長(zhǎng)速率[24-25]。由于吸光度和濃度之間有直接的相關(guān)性，因此，本研究從眾多的測(cè)量成核和晶體生長(zhǎng)速率的方法中選擇紫外-分光光度計(jì)[26-29]，通過(guò)監(jiān)測(cè)透射率吸收-時(shí)間曲線，觀察透射率的急劇變化，可以快速、方便地確定分子的結(jié)晶傾向。本研究基于過(guò)飽和體系下藥物的結(jié)晶過(guò)程，對(duì)晶體成核和生長(zhǎng)行為進(jìn)行分類，是一種有效的評(píng)價(jià)方法，可為無(wú)定形固體分散體制劑開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突