基于HPLC指紋圖譜和多指標定量的黃芩趁鮮加工研究

張雪梅，張劉偉，何凱樂，劉景玲，許宏亮，梁宗鎖,4*

1.西北農林科技大學化學與藥學院，陜西 楊凌 712100

2.西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100

3.天津天士力現代中藥資源有限公司，天津 300400

4.浙江理工大學生命科學與醫藥學院，浙江 杭州 310018

黃芩是唇形科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，是我國常用的大宗藥材之一，具有瀉火解毒、清熱燥濕、止血安胎等功效[1]。黃芩含有多種化學成分，近年來，已從黃芩中發現了多種化學成分，包括黃酮類、酚酸類、苯乙醇、氨基酸、甾醇、精油、微量元素等[2]。黃酮類是黃芩的主要有效成分，包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A 等，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、降血壓等多種現代藥理活性[3-6]。其中黃芩苷（黃芩素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）是黃芩中黃酮類成分的代表，是評價黃芩藥材質量的主要依據[7-9]。近年來，由于人工采挖較為頻繁，黃芩資源短缺，人工種植黃芩也越來越多，栽培黃芩已成為黃芩藥材的主要來源[10-11]。

中藥材采收后，除鮮用外，一般都必須進行初步處理與干燥。中藥材產地干燥初加工是中藥材初加工或產地加工過程中不可缺少的環節[12]。采收后，含水量較高，若不及時加工處理，很容易霉爛變質，嚴重影響藥材質量、臨床療效以及藥農的經濟效益。而趁鮮加工作為新型加工方法，打破了傳統加工的限制，不僅節省工時，保障藥材質量，而且運輸方便，節約成本，已成為藥材加工的主流方向。目前，已有多種藥材可進行產地加工[13-17]。而基于黃芩鮮藥材產地加工方法的研究，只有部分報 道[18-20]，大都以比較研究陰干、曬干、烘干等不同干燥方法對黃芩苷等指標成分的影響，尚未形成完整的鮮切加工技術體系和質量控制體系。因此，本實驗通過外觀性狀、浸出物含量、有效成分含量對黃芩進行質量評價，結合指紋圖譜對趁鮮加工進行研究，探討黃芩趁鮮加工代替傳統加工的可行性，尋找黃芩最佳加工工藝，旨在為黃芩產地加工以及質量標準制定提供科學依據。

1 儀器與試藥

Waters1525 二元高效液相色譜儀、Waters2996二極管陣列檢測器、Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Empower 2 色譜分析軟件，美國Waters 公司；優普超純水機，上海優普科技公司；BSA224S-CW 型萬分之一天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司；Precisa 225SM-DR 型十萬分之一天平，上海精科天美科學儀器有限公司；XMTD-8222 型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；BJ-150 型多功能粉碎機，德清拜杰電器有限公司；Eppendorf 5430R 型高速冷凍離心機，北京世貿遠東科學儀器有限公司；SB25-12 DTD型超聲波清洗機，功率600 W，頻率40 kHz，寧波新芝生物科技股份有限公司。

對照品黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素，批號分別為 P20A9F59353、R27M10F89336、C07M10Y87479、T11J11R108209，上海源葉生物公司；甲醇，色譜純，德國Merck 公司；磷酸，色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水，自制；甲醇、乙醇，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。黃芩鮮藥材于2020年3月采挖于陜西省銅川市宜君縣黃芩基地，經浙江理工大學梁宗鎖教授鑒定為唇形科黃芩屬植物 5年生黃芩S.baicalensisGeorgi 的干燥根。

2 方法與結果

2.1 黃芩加工方法

2.1.1 趁鮮加工 將采挖后的新鮮黃芩根條除去泥土及雜質后，按照表1 加工處理后，切制1～2 mm薄片，60 ℃烘干。共13 組，每組重復3 次，編號S1～S13。

2.1.2 傳統加工 將采挖后的新鮮黃芩根條除去泥土及雜質后，按照表1 加工處理，使至完全干燥，濕熱軟化后切制1～2 mm 薄片，60 ℃烘干。共3組，每組重復3 次，編號S14～S16。

2.2 不同加工方法對黃芩含水率及外觀性狀影響

水分測定方法參考《中國藥典》2020年版四部0832 水分測定法中的第二法烘干法[21]。結果見表1和圖1。所有批次的黃芩干燥后的含水率在4.13%～5.51%。陰干加工處理含水率在27.63%～42.33%時切制，干燥后其切面與傳統陰干較接近，沒有發綠現象，其余陰干批次飲片均發綠。自然干燥加工處理含水率在20.45%～43.12%時切制，干燥后其切面與傳統自然干燥較接近，無發綠現象。60 ℃烘干加工處理無論趁鮮加工還是傳統加工飲片切面嚴重發綠，甚至呈現褐綠色。

表1 切制前不同加工處理黃芩藥材基本信息及不同加工方法黃芩藥材性狀比較Table 1 Basic information of different processing of S.baicalensis before cutting and comparison of properties of S.baicalensis with different processing methods

2.3 浸出物測定

醇溶性浸出物參考《中國藥典》2020年版四部2201 浸出物測定法中的熱浸法，以稀乙醇代替水為溶劑[21]。結果見表2。所有批次加工處理后的黃芩飲片浸出物含量均達標，黃芩醇溶性浸出物在44.16%～52.05%，S3 最大，S1 最小。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液，體積流量0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長277 nm，梯度洗脫：0～10 min，30%～40%甲醇；10～20 min，40%～50%甲醇；20～30 min，50%甲醇；30～40 min，50%～60%甲醇；40～50 min，60%～70%甲醇；50～60 min，70%～30%甲醇。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素各對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為2 871.80、1 000.00、657.50、100.00 μg/mL 的混合對照品溶液，于4 ℃冰箱中避光保存備用。

2.4.3 供試品溶液制備 精密稱取黃芩中粉0.2 g，于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液25 mL，精密稱定質量，超聲提取（功率600 W，頻率40 kHz）40 min，放冷至室溫，補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

2.4.4 重復性試驗 取同一批黃芩粉末（S5）6 份，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果主要共有峰的相對保留時間的RSD 在0.61%～0.74%，主要共有峰的相對峰面積RSD 在1.67%～2.21%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 精密性試驗 取同一份黃芩供試品溶液（S5），按“2.4.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄色譜圖。結果主要共有峰的相對保留時間的RSD在0.44%～1.77%，主要共有峰的相對峰面積RSD在0.45%～1.44%，表明儀器精密性良好。

2.4.6 穩定性試驗 取同一份黃芩供試品溶液（S5），按“2.4.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h 進樣分析，記錄色譜圖。結果主要共有峰的相對保留時間的RSD≤1.16%，主要共有峰的相對峰面積RSD 在0.45%～2.34%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

圖1 不同加工處理黃芩外觀性狀差異Fig.1 Differences in appearance characteristics of different processing S.baicalensis

表2 切制前不同加工處理下黃芩的浸出物 ( ± s, n = 3)Table 2 S.baicalensis extract content of different processing before cutting ( ± s, n = 3)

表2 切制前不同加工處理下黃芩的浸出物 ( ± s, n = 3)Table 2 S.baicalensis extract content of different processing before cutting ( ± s, n = 3)

與S14 比較：*P＜0.05；與S15 比較：#P＜0.05；與S16 比較：&P＜0.05（同一種干燥方式的趁鮮加工與傳統加工相比較），表6 同*P ＜ 0.05 vs S14; #P ＜ 0.05 vs S15; &P ＜ 0.05 vs S16 (compared with traditional processing in the same drying method), same as table 6

編號 醇溶性浸出物/% RSD/% 編號 醇溶性浸出物/% RSD/%S1 44.16±0.72*#& 1.63 S9 48.23±0.28# 0.58 S2 49.35±0.26* 0.54 S10 46.92±0.16& 0.34 S3 52.05±0.62* 1.20 S11 48.98±0.76 1.55 S4 46.82±0.16* 0.34 S12 47.14±1.03& 2.18 S5 44.50±0.08* 0.19 S13 47.25±1.35& 2.86 S6 48.58±0.05# 0.11 S14 48.18±0.50 1.03 S7 49.72±0.12 0.24 S15 50.17±0.72 1.44 S8 46.76±0.57# 1.21 S16 49.53±0.81 1.64

2.4.7 不同加工處理的黃芩指紋圖譜建立及相似度評價 將16 批黃芩供試品HPLC 圖譜數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，設定S1 為參照圖譜，采用中位數法，時間窗寬度為0.1，進行多點校正，進行匹配，生成對照圖譜（R），結果見圖2。共標定22 個共有峰（占總峰面積90%以上），經過加入對照品，比對保留時間，共指認了4個色譜峰，分別為11 號色譜峰黃芩苷，16 號色譜峰漢黃芩苷，19 號色譜峰黃芩素，21 號色譜峰漢黃芩素，結果見圖3。以16 號共有峰為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD 在0.066%～0.770%，結果見表3。而共有峰的相對峰面積RSD 均遠大于5%（表4）。這表明不同加工處理下黃芩的化學成分組成基本一致，但同一種化學成分的含量差異很大。16 批樣品相對于對照圖譜的相似性分析見表5。相似度在0.992～1.000，相似度較高。

圖2 16 批不同加工處理黃芩指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of 16 batches of different processing S.baicalensis

2.4.8 聚類分析 將16 批不同加工處理的黃芩飲片的HPLC 指紋圖譜中的22 個共有峰峰面積相對于藥材稱樣量量化，運用SPSS 24.0 軟件進行系統 聚類分析，采用組間聯接法，平方歐氏距離作為樣品的距離度，結果見圖4。分析結果顯示，在類間距離為5 時，16 個樣品可以聚為4 類，其中S5、S6 為第1 類，S1、S10～S13、S16 為第2 類，S2～S4 為第3 類，S7～S9、S14、S15 為第4 類。所有烘干處理全部聚為一類，而其他處理即使干燥方法一致，含水率不同時切制，干燥后也可能聚為不同類，同一種干燥方式下的趁鮮加工和傳統加工也聚為不同類別。樣品來源均為銅川5年生黃芩，卻歸屬不同類，可能與藥材加工處理方法的不同有關。說明不同的加工處理會直接影響藥材質量。

2.5 黃芩中4 種有效成分含量的測定

2.5.1 色譜條件 同“2.4.1”項。在此條件下，各色譜峰都能很好地分離，色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品的HPLC 圖 (A) 及黃芩藥材HPLC 對照指紋圖譜 (R)Fig.3 HPLC of mixed reference substances (A) and HPLC reference fingerprint of S.baicalensis (R)

2.5.2 對照品溶液制備 同“2.4.2”項。

2.5.3 供試品溶液制備 同“2.4.3”項。

2.5.4 線性關系考察 精密吸取已配制好的混合對照品溶液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50 mL，分別置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密吸取上述混合對照品溶液各10 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），對照品溶液質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程分別為黃芩素Y＝6.29×107X－3.92×105，R2＝0.999 8，線性范圍6.58～657.50 μg/mL；漢黃芩素Y＝7.21×107X－1.92×104，R2＝0.999 7，線性范圍1.00～100.00 μg/mL；黃芩苷Y＝4.36×107X－8.20×104，R2＝0.999 7，線性范圍28.72～2 871.80 μg/mL；漢黃芩苷Y＝5.27×107X－4.67×105，R2＝0.999 6，線性范圍10.00～1 000.00 μg/mL。

表3 16 批不同加工處理的黃芩圖譜共有峰的相對保留時間Table 3 Relative retention time of common peaks of 16 batches of different processing of S.baicalensis

表4 16 批不同加工處理的黃芩圖譜共有峰的相對峰面積Table 4 Relative peak areas of common peaks of 16 batches of different processing S.baicalensis

續表4

表5 16 批不同加工處理的黃芩圖譜共有峰相似度結果Table 5 Similarity results of common peaks of 16 batches of different processing S.baicalensis

2.5.5 加樣回收率試驗 取同一批黃芩粉末（S5）6 份，按各成分在藥材中含量的差異，每份加入適量對照品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進行測定，分別計算各對照品的回收率。結果黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的平均加樣回收率依次為 104.83%、102.66%、96.92%、100.38%，RSD 依次為2.34%、0.96%、3.52%、1.71%，表明該方法回收率良好。

圖4 不同加工處理的黃芩聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram of S.baicalensis under different processing

2.5.6 有效成分含量測定 將16 批不同加工處理的黃芩按“2.4”項下方法制備并進行進樣檢測，結果見表6。陰干條件下，在含水率27.63%時切制，趁鮮加工黃芩苷與漢黃芩苷含量最高，此時與傳統加工無顯著差異；黃芩素含量和漢黃芩素含量均顯著高于傳統加工，在含水率為63.66%時切制含量最高，分別比傳統加工高2.72 倍和1.66 倍。

表6 切制前不同加工處理下黃芩藥材有效成分含量 ( ± s, n = 3)Table 6 Content of effective ingredients of S.baicalensis under different processing before cutting ( ± s, n = 3)

表6 切制前不同加工處理下黃芩藥材有效成分含量 ( ± s, n = 3)Table 6 Content of effective ingredients of S.baicalensis under different processing before cutting ( ± s, n = 3)

編號 質量分數/% 黃芩苷 漢黃芩苷 黃芩素 漢黃芩素 S1 15.126 1±0.123 7*# 2.723 5±0.010 2*#& 2.516 8±0.030 8*#& 0.579 5±0.004 9*#& S2 17.923 2±0.169 2* 3.498 8±0.031 1* 1.360 5±0.026 0* 0.409 9±0.010 1* S3 18.595 3±0.246 0 3.107 0±0.023 3* 1.485 4±0.016 9* 0.313 5±0.003 5* S4 17.979 1±0.433 9* 3.252 2±0.019 0* 1.599 0±0.048 7* 0.299 0±0.005 3* S5 19.265 3±0.178 9 3.613 7±0.044 2 1.190 7±0.022 5* 0.196 6±0.003 5* S6 16.415 0±0.098 6# 2.969 2±0.049 7# 1.132 3±0.038 8# 0.287 1±0.006 1# S7 19.031 1±0.239 3 3.820 0±0.013 0# 0.930 4±0.012 1# 0.246 8±0.001 9# S8 20.112 7±0.363 0# 3.568 4±0.002 8# 0.906 3±0.012 0# 0.196 5±0.001 0 S9 18.986 4±0.262 9 3.621 7±0.028 7# 0.753 1±0.003 1# 0.254 9±0.001 2# S10 15.913 7±0.135 6& 3.281 4±0.033 0& 1.740 1±0.012 2 0.463 7±0.002 9 S11 16.262 2±0.344 8& 3.173 2±0.030 2& 2.050 3±0.010 2& 0.546 5±0.004 3& S12 15.031 6±0.077 5 2.922 8±0.012 6 2.224 5±0.011 2& 0.567 3±0.003 8& S13 16.012 5±0.093 2& 2.865 4±0.053 6 1.787 6±0.056 7& 0.437 9±0.010 2& S14 18.914 1±0.254 8 3.614 4±0.038 1 0.676 2±0.013 0 0.217 6±0.004 9 S15 18.859 9±0.607 8 4.024 0±0.014 1 0.501 0±0.007 5 0.199 2±0.001 0 S16 15.197 1±0.118 6 2.905 3±0.049 9 1.712 7±0.031 1 0.474 3±0.008 1

自然干燥條件下，在含水率為25.66%時切制，趁鮮加工黃芩苷含量最高，比傳統加工高0.07 倍，含水率20.45%和35.22%時切制，干燥后黃芩苷含量和傳統加工相比無顯著差異；漢黃芩苷含量均顯著低于傳統加工；黃芩素和漢黃芩素含量大都高于傳統加工，在含水率為63.66%時切制，含量最高，分別比傳統加工高4.02 倍和1.91 倍。

60 ℃烘干條件下，趁鮮加工含水率為49.81%時切制，黃芩苷含量最高，比傳統加工高0.07 倍，含水率19.22%和57.04%次之；在含水率57.04%時切制，漢黃芩苷含量最高，比傳統加工高0.13 倍，含水率49.81%次之；在含水率63.66%時切制，黃芩素和漢黃芩素含量均最高，分別比傳統加工高0.47 倍和0.22 倍。

3 討論

不同加工處理的黃芩干燥后對外觀性狀的影響較大。研究表明，黃芩苷等苷類成分在高溫濕熱環境中，稍不注意就會加速酶解，導致含量降低，進而影響質量。陰干在含水率較高（52.82%以上）時切制，由于飲片本身的含水率高，置于60 ℃干燥時，飲片受自身較高水分和烘箱溫度的影響，會促進苷類的酶解，致使切面發綠。而黃芩無論烘至含水率多少切制，干燥后飲片外觀顏色都有不同程度發綠，大大影響飲片美觀。黃芩栓皮較厚，透氣性差，即使含水率降至很低切制，由于溫度相對較高，隨著烘干時間的延長，根條也未切制，致使根條內部持續發熱，內部的熱氣無法發散出去，為一系列復雜的酶促、氧化、聚合等生化反應創造了有力條件，黃芩苷被酶解為黃芩素[22-24]。黃芩素結構中含有3 個鄰位的酚羥基，易被氧化轉變為醌類衍生物而顯綠色[25]。黃芩變綠后，有效成分受到破壞，質量隨之降低。

指紋圖譜研究通過對黃芩的各個化學成分進行整體評價，標定了許多共有峰。除此之外對《中國藥典》規定以外的一些其他成分進行含量測定，指認除《中國藥典》規定的其他成分。并進行指紋圖譜的相似性分析、相對保留時間和相對峰面積的分析，更能全面反映出不同加工處理的黃芩藥材的質量是否均一，化學成分相差是否較大。本研究通過外觀性狀差異、浸出物含量、有效成分含量，結合指紋圖譜，得出最佳干燥工藝為自然干燥至含水率20.45%～35.22%時對黃芩進行切制，60 ℃烘干。在聚類分析中，自然干燥至含水率20.45%～35.22%時切制并60 ℃烘干的飲片，與相應的傳統加工聚為一類，進一步說明了趁鮮加工可以代替傳統加工。趁鮮加工在保障藥材質量的同時，省時省力，節省成本，也避免了二次加工中有效成分的流失。本研究為黃芩的產地加工、質量標準建立提供了重要的參考價值。此外，不同加工方法導致藥材的質量差異，進而影響臨床療效，因此不同加工方法引起的藥效變化有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突