溪黃草甲素對脂多糖誘導的炎性反應的作用及機制研究

孫禮芹，李光霞，王 瑞，李醫明，錢 菲，賈 琦*

1.上海中醫藥大學中藥學院，上海 201203

2.上海中醫藥大學交叉科學研究院，上海 201203

炎性反應是機體應對病原體、感染或組織損傷的保護性反應，但失控的炎性反應會對機體造成損傷[1]，因此控制體內炎性反應的動態平衡至關重要。巨噬細胞及其釋放的炎性介質在炎性反應的發生發展過程中扮演著重要的角色[2]。除具有吞噬功能外，巨噬細胞還可以在脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）等刺激物的誘導下被激活，從而誘導合成并釋放大量腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）等炎性介質，進而引起炎性反應[3-5]。因此，抑制巨噬細胞的過度活化對抑制炎性反應具有重要意義。溪黃草Rabdosia serra(Maxim.) Hara 為唇形科香茶菜屬植物，別名熊膽草、風血草、黃汁草等，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀的功效[6-7]?，F代藥理學研究表明，溪黃草具有抗炎、抗腫瘤、抑菌、增強免疫及保肝利膽等作用。溪黃草甲素是溪黃草中重要的二萜類成分之一，目前僅發現其對人宮頸癌細胞HeLa 的增殖具有顯著的抑制作用[8]，但對其抗炎作用方面的研究鮮有報道。本研究采用LPS 誘導小鼠建立急性炎性反應模型，并誘導小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 細胞建立體外炎性細胞模型，探究溪黃草甲素的抗炎作用及機制，為臨床抗炎藥物的開發提供依據。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性BALB/c 小鼠45 只，6 周齡，體質量20～22 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（浙）2020-0002。動物飼養于上海中醫藥大學動物實驗樓，溫度20～26 ℃、相對濕度40%～60%，光照明暗交替各12 h，自由進食飲水。動物實驗經上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號PZSHUTCM200904008）。

1.2 細胞

RAW264.7 細胞為本課題組保存。

1.3 藥品與試劑

溪黃草甲素（質量分數≥98%）為本課題組自制；DMEM 高糖培養基（批號8120449）購自美國Gibco 公司；胎牛血清（批號17M483）、LPS（批號 078M4039V）、二甲基亞砜（DMSO，批號RNBH5492）購自美國Sigma 公司；XTT 試劑盒（批號32141000）購自德國Roche 公司；TNF-α ELISA試劑盒（批號227846-005）、IL-6 ELISA 試劑盒（批號234277-003）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶抑制劑（批號410064）、磷酸酶抑制劑（批號510033）購自美國Selleck 公司；RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑（批號020617170522）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號080919190917）購自上海碧云天生物技術有限公司；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體、c-Jun 氨基端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）抗體、磷酸化JNK（p-JNK）抗體、細胞外調節蛋白激酶 1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）抗體、p-ERK1/2 抗體、p38 抗體、p-p38 抗體、p65抗體、Janus 酪氨酸蛋白激酶2（Janus kinase 2，JAK2）抗體、p-JAK2 抗體、信號轉導子與轉錄激活子蛋白 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體、p-STAT3 抗體、核因子-κB 抑制蛋白α（inhibitor nuclear factor-κB α，IκBα）抗體、p-IκBα 抗體購自美國CST 公司；小鼠源重組IL-6 、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號DJ18）、Histone H3 抗體（批號A25J）、HRP 標記的山羊抗兔IgE 抗體（批號AS007）、HRP標記的山羊抗小鼠IgE 抗體（批號AS006）購自愛必信生物科技有限公司；ECL 發光液（批號1916102）購自美國Millpore 公司。

1.4 儀器

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

BALB/c 小鼠隨機分為對照組、模型組及溪黃草甲素低、高劑量（50、100 mg/kg）[9-10]組和地塞米松（5 mg/kg）組，每組9 只。以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）作為助溶劑并進行研磨，將溪黃草甲素配制成質量濃度為2.5、5.0 mg/mL 的混懸液，將地塞米松配制成質量濃度為0.25 mg/mL 的混懸液。各給藥組ig 相應藥物（20 mL/kg），對照組和模型組ig 0.5% CMC-Na，1 次/d，連續2 d。LPS溶于0.9%氯化鈉溶液配制成質量濃度為1 mg/mL的溶液，末次給藥1 h 后，模型組和各給藥組ip LPS（10 mL/kg）刺激6 h 建立急性炎性小鼠模型，對照組ip 等體積0.9%氯化鈉溶液。

2.2 溪黃草甲素對LPS 誘導的急性炎性小鼠模型血清中TNF-α 和IL-6 水平的影響

各組小鼠眼眶取血后，ip 戊巴比妥鈉處死，分離并得到血清，按ELISA 試劑盒說明書測定血清中TNF-α 和IL-6 水平。

2.3 細胞培養

RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，當細胞融合度達到50%時，采用一次性細胞刮刀進行脫壁并傳代，待細胞透明、邊界清晰后進行實驗。

2.4 溪黃草甲素對RAW264.7 細胞存活率的影響

RAW264.7 細胞以2.5×105/mL 接種于96 孔板中，于培養箱中培養。設置對照組、溪黃草甲素（0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 μmol/L）組，溪黃草甲素溶于DMSO，配制成25 mmol/L 的母液，使用時以培養基稀釋至相應濃度。各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h；每孔加入50 μL XTT，培養4 h，振蕩30 s，采用酶標儀測定492、690 nm 處的吸光度（A）值，計算細胞存活率。

2.5 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中NO 水平的影響

RAW264.7 細胞以5×105/mL 接種于96 孔板中，于培養箱中培養。設置對照組、模型組、溪黃草甲素（0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 μmol/L）組。各給藥組加入溪黃草甲素預處理30 min，模型組和各給藥組再加入LPS（0.5 μg/mL）刺激24 h，對照組加入不含藥物的培養基。采用Griess 法檢測細胞上清液中NO 水平。

2.6 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞iNOS 蛋白表達的影響

RAW264.7 細胞以5×105/mL 接種于100 mm細胞培養皿中，于培養箱中培養。設置對照組、模型組、溪黃草甲素（1.25、2.50、5.00 μmol/L）組。按“2.5”項下方法進行處理，收集細胞，加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，于95 ℃水浴加熱10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入iNOS、GAPDH 抗體，4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌5 次，5 min/次，加入HRP 標記的山羊抗兔IgE 抗體，室溫孵育1 h，TBST 洗滌后，加入ECL 發光液顯影，采用Image J 分析條帶灰度值。

2.7 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平的影響

RAW264.7 細胞以5×105/mL 接種于96 孔板中，于培養箱中培養。按“2.6”項下方法進行分組和處理，收集細胞上清液，按試劑盒說明書測定細胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平。

2.8 溪黃草甲素對LPS誘導的RAW264.7細胞JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達的影響

RAW264.7 細胞以5×105/mL 接種于100 mm細胞培養皿中，于培養箱中培養。按“2.6”項下方法進行分組，各給藥組加入溪黃草甲素預處理30 min，模型組和各給藥組再加入LPS（0.5 μg/mL）刺激4 h，對照組加入不含藥物的培養基。收集細胞，按“2.6”項下方法檢測細胞JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3 蛋白表達情況。

做好基建工程項目檔案資料管理工作，可以為工程的各環節提供真實可靠數據，使工程項目順利完成。在開展基建工程項目中，對檔案資料進行科學化管理和監控，做好基建檔案管理是一項必不可少的工作。

2.9 溪黃草甲素對IL-6 誘導的RAW264.7 細胞STAT3 和p-STAT3 蛋白表達的影響

RAW264.7 細胞以5×105/mL 接種于100 mm細胞培養皿中，于培養箱中培養。按“2.6”項下方法進行分組，各給藥組加入溪黃草甲素預處理30 min，模型組和各給藥組再加入IL-6（3 ng/mL）刺激30 min，對照組加入不含藥物的培養基。收集細胞，按“2.6”項下方法檢測細胞STAT3 和p-STAT3蛋白表達情況。

2.10 溪黃草甲素對LPS 誘導RAW264.7 細胞不同時間后的上清液中IL-6 水平的影響

RAW264.7 細胞以5×105/mL 接種于96 孔板中，于培養箱中培養。設置模型組和溪黃草甲素（5 μmol/L）組，給藥組加入溪黃草甲素預處理30 min，模型組和給藥組再加入LPS（0.5 μg/mL）分別刺激1、2、3、4、6、8、12、16、24 h，收集細胞上清液，按ELISA 試劑盒說明書測定各時間點細胞上清液中IL-6 水平。

2.11 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞NF-κB 與MAPK 信號通路相關蛋白表達的影響

RAW264.7 細胞以5×105/mL 接種于100 mm細胞培養皿中，于培養箱中培養。按“2.6”項下方法進行分組，各給藥組加入溪黃草甲素預處理30 min，模型組和各給藥組再加入LPS（0.5 μg/mL）刺激30 min，對照組加入不含藥物的培養基。收集細胞，加入RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，或采用細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑提取細胞核與胞質蛋白，按“2.6”項下方法檢測細胞p-IκBα、p65、p-JNK、p-ERK1/2、p-p38 蛋白表達情況。

2.12 統計學分析

數據以±s表示，使用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統計，采用單因素方差分析和t檢驗進行差異比較。

3 結果

3.1 溪黃草甲素對LPS 誘導的急性炎性小鼠模型血清中TNF-α 和IL-6 水平的影響

如圖1 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組血清中TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05、0.001），溪黃草甲素（100 mg/kg）組和地塞米松組血清中IL-6 水平顯著降低（P＜0.01、0.001），表明溪黃草甲素對LPS 誘導的小鼠急性炎性反應具有抑制作用。

圖1 溪黃草甲素對LPS 誘導的急性炎性小鼠模型血清中TNF-α 和IL-6 水平的影響 ( ± s, n = 9)Fig.1 Effect of rabdoserrin A on TNF-α and IL-6 levels in serum of acute inflammation mice model induced by LPS ( ± s, n = 9)

3.2 溪黃草甲素對RAW264.7 細胞存活率的影響

如圖2 所示，與對照組比較，各劑量溪黃草甲素對RAW264.7 細胞存活率均無顯著影響。

3.3 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中NO 水平的影響

如圖3 所示，與對照組比較，模型組細胞上清液中NO 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，溪黃草甲素（0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 μmol/L）組細胞上清液中NO 水平顯著降低（P＜0.05、0.001），呈劑量相關性，其半數抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）值為2.68 μmol/L。 因此，選取1.25、2.50、5.00 μmol/L 3 個濃度展開后續實驗。

圖 2 溪黃草甲素對 RAW264.7 細胞存活率的影響 ( ± s , n=3)Fig.2 Effect of rabdoserrin A on survival rate of RAW264.7 cells ( ± s , n=3)

圖3 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中NO 水平的影響 ( ± s , n=3)Fig.3 Effect of rabdoserrin A on NO level in supernatant of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

3.4 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞iNOS 蛋白表達的影響

如圖4 所示，與對照組比較，模型組細胞iNOS蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，溪黃草甲素（2.50、5.00 μmol/L）組細胞iNOS 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖4 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞iNOS 蛋白表達的影響 ( ± s , n=3)Fig.4 Effect of rabdoserrin A on iNOS expression of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

3.5 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平的影響

如圖5 所示，與對照組比較，模型組細胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各劑量溪黃草甲素組上清液中IL-6 水平顯著降低（P＜0.001），溪黃草甲素（2.50、5.00 μmol/L）組上清液中TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05、 0.01），且呈劑量相關性，表明溪黃草甲素能夠抑制LPS 誘導的RAW264.7 細胞的炎性反應。

圖5 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中TNF-α 和IL-6 水平的影響 ( ± s , n=3)Fig.5 Effect of rabdoserrin A on TNF-α and IL-6 levels of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

3.6 溪黃草甲素對LPS誘導的RAW264.7細胞JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達的影響

如圖6 所示，與對照組比較，模型組p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，各劑量溪黃草甲素組p-STAT3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），溪黃草甲素（2.50、5.00 μmol/L）組p-JAK2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01），且呈劑量相關性。

圖6 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞JAK2、p-JAK2、STAT3 和p-STAT3 蛋白表達的影響 ( ± s , n=3)Fig.6 Effect of rabdoserrin A on expressions of JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

3.7 溪黃草甲素對IL-6 誘導的RAW264.7 細胞STAT3 和p-STAT3 蛋白表達的影響

JAK2/STAT3 的激活可以促進IL-6 的產生，IL-6能夠與胞膜上的受體結合，進一步激活JAK2/ STAT3 信號通路。如圖7 所示，與對照組比較，模型組p-STAT3 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，溪黃草甲素（2.50、5.00 μmol/L）組p-STAT3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.001），且呈劑量相關性。

圖7 溪黃草甲素對IL-6 誘導的RAW264.7 細胞STAT3 和p-STAT3 蛋白表達的影響 ( ± s , n=3)Fig.7 Effect of rabdoserrin A on expressions of STAT3 and p-STAT3 of RAW264.7 cells induced by IL-6 ( ± s , n=3)

3.8 溪黃草甲素對LPS 誘導RAW264.7 細胞不同時間后的上清液中IL-6 水平的影響

如圖8 所示，LPS 誘導RAW264.7 細胞4 h 時，IL-6 未顯著釋放，而溪黃草甲素已經能夠顯著抑制p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達水平，表明LPS 誘導RAW264.7 細胞4 h，溪黃草甲素對JAK2/STAT3 的下調與IL-6 分泌無關。

圖8 溪黃草甲素對LPS 誘導RAW264.7 細胞不同時間后的上清液中IL-6 水平的影響 ( ± s , n=3)Fig.8 Effect of rabdoserrin A on IL-6 level of RAW264.7 cells induced by LPS for different time ( ± s , n=3)

3.9 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞NF-κB 與MAPK 信號通路相關蛋白表達的影響

如圖9、10 所示，LPS 誘導RAW264.7 細胞30 min 時，與對照組比較，模型組p-IκBα、胞核p65、p-JNK、p-ERK1/2、p-p38 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組對NF-κB 與MAPK 信號通路相關蛋白表達水平無明顯影響。

圖9 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞NF-κB 信號通路相關蛋白表達的影響 ( ± s , n=3)Fig.9 Effect of rabdoserrin A on NF-κB signaling pathway related protein expressions of RAW264.7 cells induced by LPS( ± s , n=3)

4 討論

巨噬細胞在炎性反應的發展中發揮著重要的作用[11]。LPS 可以促使巨噬細胞分泌NO、TNF-α、IL-6等多種促炎介質，引起炎性反應的發生與發展[12]。本研究結果顯示，0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0、5.000 0 μmol/L 溪黃草甲素對RAW264.7 細胞的活力無明顯抑制作用，溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞上清液中NO 水平的IC50值為2.68 μmol/L。因此，后續選擇1.25、2.50、5.00 μmol/L進行研究。溪黃草甲素顯著抑制 LPS 誘導的RAW264.7 細胞中NO 合成關鍵酶（iNOS）[13]蛋白表達水平。TNF-α 和IL-6 是2 種重要的促炎細胞因子，LPS 可以誘導其大量分泌，而溪黃草甲素可以顯著抑制二者的產生，在LPS 誘導的急性炎性小鼠 體內，溪黃草甲素也具有同樣的抑制作用。以上結果表明溪黃草甲素具有良好的抗炎作用，提示溪黃草甲素是溪黃草發揮抗炎作用的物質基礎之一。

圖10 溪黃草甲素對LPS 誘導的RAW264.7 細胞MAPK 信號通路相關蛋白表達的影響 ( ± s , n=3)Fig.10 Effect of rabdoserrin A on MAPK signaling pathway related protein expressions of RAW264.7 cells induced by LPS ( ± s , n=3)

STAT3 是一種關鍵調節因子，在炎性反應中發揮著重要的作用[14]。JAK2/STAT3 信號的激活由IL-6 識別細胞膜表面受體并與之結合，誘導gp130形成同源二聚體，進一步激活JAK，激活后的JAK會使gp130 胞內結構域上的酪氨酸殘基磷酸化，從而招募STAT3，這種激酶級聯使STAT3 磷酸化后形成二聚體并轉移到細胞核，進而調控炎性細胞因子的表達，促進IL-6 等炎性因子分泌至胞外[15]。溪黃草甲素顯著抑制RAW264.7 細胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表達水平，表明溪黃草甲素可能通過JAK2/ STAT3 途徑發揮抗炎作用。IL-6 可以介導JAK2/ STAT3 的激活[16-17]，本研究采用IL-6 作為刺激劑對RAW264.7 細胞進行誘導，發現溪黃草甲素顯著抑制IL-6 誘導的RAW264.7 細胞中p-STAT3 蛋白表達水平。STAT3 的磷酸化可以調控LPS 誘導的巨噬細胞中IL-6 的產生[18]，而IL-6 又可以通過gp130/JAK/ STAT 途徑調節p-STAT3 蛋白表達[17]。為了確定溪黃草甲素對p-STAT3蛋白表達與IL-6分泌抑制作用的先后關系，本研究通過檢測LPS 刺激RAW264.7細胞不同時間的 IL-6 分泌，發現 LPS 刺激RAW264.7 細胞4 h 時，IL-6 還未顯著釋放，但此時溪黃草甲素已經顯著抑制p-STAT3 蛋白表達水平，表明溪黃草甲素通過抑制JAK2/STAT3/IL-6 信號通路，從而發揮抗炎作用。

綜上所述，本研究發現溪黃草甲素能夠抑制LPS 誘導的體內外炎性反應，其作用機制與抑制JAK2/STAT3 信號通路有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突