龍鱉膠囊含藥血清通過調控Hippo-YAP信號通路促進骨髓間充質干細胞遷移研究

梁桂洪，黃和濤，曾令烽，楊 園，趙金龍，潘建科，楊偉毅，陳紅云，羅明輝，韓燕鴻，劉 軍*

1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院（廣東省中醫院）骨科，廣東 廣州 510120

2.廣東省中醫藥科學院 骨與關節退變及損傷研究團隊，廣東 廣州 510120

關節軟骨因缺乏血管、神經和淋巴液的營養供應，導致其自我修復能力受到限制，損傷后難以再生，從而引起骨關節炎（osteoarthritis，OA）等退行性疾病，嚴重影響中老年人的關節活動[1]。目前關于關節軟骨修復的方法主要有自體軟骨移植、骨軟骨移植、干細胞治療和基因治療等[2]。然而，提取自體軟骨細胞會對供體部位造成一定的損傷，移植的外源性軟骨細胞遷移能力弱，不能有效地聚集到損傷部位，且移植后分泌細胞外基質的功能明顯減弱，不能與軟骨下板很好地融合，從而降低自體軟骨細胞移植治療效果[3]。骨髓間充質干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）是最常用的間充質干細胞（marrow stromal cells，MSCs），由于其具有易獲得、多向分化和定向遷移的特性，在骨和軟骨修復中得到廣泛的研究和應用[4-5]。當機體組織出現損傷后，BMSCs 因具有較強的遷移能力，可以遷移至損傷處并對損傷組織進行修復[6]，因此增強BMSCs 的遷移能力有助于促進損傷后的軟骨修復。

Hippo-Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）信號通路是調控MSCs 增殖和分化的重要通路[7]。BMSCs 的增殖、分化、遷移等生物學功能均受Hippo-YAP 信號通路的影響[8]。抑制Hippo 信號通路能夠提高BMSCs 在體外的增殖和遷移能力[9]。YAP 作為Hippo-YAP 信號通路中的效應基因，具有調節BMSCs 向成骨和成脂方向分化的作用[10]。本課題組前期研究表明，龍鱉膠囊具有保護和修復OA 關節軟骨組織的作用[11]，且龍鱉膠囊聯合BMSCs 治療OA 的效果更為顯著[12]；龍鱉膠囊能夠促進BMSCs 增殖[13]。本研究通過考察龍鱉膠囊對BMSCs 中Hippo-YAP 信號通路和遷移功能的影響，為后續探究龍鱉膠囊通過促進BMSCs 歸巢和成軟骨分化修復關節軟骨的作用機制奠定基礎。

1 材料

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠10 只，雌雄各半，1.5月齡，體質量（200±10）g，購自南方醫科大學實驗動物中心，動物許可證號SYXK（粵）-2018-0094。動物飼養于廣東省中醫藥科學院實驗動物中心SPF 級環境中。動物實驗經廣東省中醫院動物倫理委員會批準（批準號2020050）。

1.2 藥品與試劑

龍鱉膠囊（批號200701，0.5 g/粒）主要由蘄蛇、全蝎、丹參、巴戟天、仙茅、土鱉蟲等補腎活血的藥物組成，由廣東省中醫院藥劑科生產[11]；SD大鼠骨髓間充質干細胞完全培養基（批號RASMX-90011）、SD 大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導分化培養基（批號RASMX-90021）、SD 大鼠骨髓間充質干細胞成脂誘導分化培養基（批號RASMX-90031）、含0.04%乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰酶（批號TEDTA-10001）購自賽業（蘇州）生物科技有限公司；青-鏈霉素雙抗（批號15140-122）、不含 EDTA 的 0.25%胰酶（批號15050065）、澳洲胎牛血清（批號10099141）、DMEM低糖培養基（批號C11885500BT）、PBS 緩沖液（批號C10010500BT）購自美國Gbico 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號D2650）購自美國Sigma 公司；YAP 抑制劑維替泊芬（Verteporfin，批號S1786）購自美國Selleck 公司；Transwell 小室（8 μm，批號353097）購自美國BD 公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號K300）購自上海博彩生物科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（批號P0012A）、結晶紫染色液（批號C0121）購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL 化學發光液（批號WBKLS0100）購自美國Millipore 公司；大型腫瘤抑制因子2（large tumor suppressor homolog 2，LATS2）抗體（批號13646）、YAP 抗體（批號14074）、β-actin 抗體（批號3700）、山羊抗兔抗體、山羊抗小鼠抗體購自美國CST 公司；結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）抗體（批號ab6992）購自英國Abcam 公司；干細胞表面標記物FITC 抗兔CD45抗體（批號202205）和同型陰性對照（批號400107）、PerCP/Cyanine5.5 抗兔CD90/抗小鼠CD90.1 抗體（批號202515）和同型陰性對照（批號400149）、Alexa Fluor 647 抗兔CD44H 抗體（批號203908）和同型陰性對照（批號400234）、PE 抗小鼠/兔CD29抗體（批號102207）和同型陰性對照（批號400907）購自美國BioLegend 公司。

1.3 儀器

311 型CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；HR40-IIA2 型生物安全柜（海爾生物醫療股份有限公司）；IC-1000 型Count Star 自動細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；5424R型高速冷凍離心機（德國 Eppendorf 公司）；Advantage A10 型超純水儀（美國Millipore 公司）；TI2-E 型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；ChemiDoc Touch 型高靈敏度化學發光成像儀（美國Bio-Rad 公司）；Novo Quanteon 型流式細胞儀（安捷倫生物）；M1000 Pro 型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）。

2 方法

2.1 龍鱉膠囊含藥血清的制備

將龍鱉膠囊內的藥粉溶于純水，配制成質量濃度為0.125 g/mL 的溶液。每日于9: 00、15: 00 時，SD 大鼠ig 龍鱉膠囊（0.625 g/kg），連續7 d。最后1 次給藥1 h 后，大鼠ip 10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，3000 r/min 離心10 min，收集含藥血清，于56 ℃水浴中孵育30 min，經0.22 μm過濾器濾過后分裝，于 ?80 ℃冰箱中保存備用。

2.2 大鼠原代BMSCs 的提取和培養

采用全骨髓細胞培養法提取和培養大鼠BMSCs。大鼠ip 10%水合氯醛（7 mL/kg）處死，于75%乙醇中浸泡10 min，無菌條件下取出股骨、脛骨和肱骨，剔除肌肉組織，于含1%雙抗的PBS緩沖液中浸泡10 min；將長骨轉移至超凈工作臺，用含1%雙抗的PBS 緩沖液沖洗2 次，置于10 cm培養皿中，剪斷長骨的干骺端，加入10 mL 含1%雙抗的DMEM 低糖培養基，用10 mL 注射器抽吸培養基沖洗骨髓，收集骨髓懸液，1500 r/min 離心8 min，棄上清；加入7 mL SD 大鼠骨髓間充質干細胞完全培養基，混勻后將細胞懸液接種至25 cm2培養瓶中，于培養箱中培養48 h 后半量換液，再培養48 h 后全量換液，當細胞融合度達到90%以上，進行傳代培養。

2.3 BMSCs 表面抗原的鑒定

取第3 代BMSCs，胰酶消化后制成單細胞懸液，離心后棄上清，用預冷的PBS 洗滌2 次，調整細胞密度為1×107/mL。各取100 μL 細胞懸液，分別加入CD29、CD44、CD45、CD90 標記物抗體，同時每份樣品設立同型陰性對照，混勻后于冰上避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達。

2.4 BMSCs 成骨誘導分化實驗

BMSCs 胰酶消化后計數，將1×105個細胞接種至包被0.1%明膠的6 孔板中，每孔加入2 mL 完全培養基，于培養箱中培養。當細胞融合度達到60%～70%，將培養基小心地吸走，按成骨誘導分化培養基試劑盒說明書，每孔中加入2 mL OriCell大鼠骨髓間充質干細胞成骨誘導分化完全培養基，每3 天更換1 次新鮮的成骨誘導液，誘導4 周后吸去誘導液，PBS 沖洗2 次；每孔加入2 mL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS 沖洗2 次；每孔加入1 mL茜素紅染液染3 min，吸去染液，PBS 沖洗2～3 次，將培養板置于倒置顯微鏡鏡下，觀察并拍照染色的效果。

2.5 BMSCs 成脂誘導分化實驗

BMSCs 胰酶消化后計數，將2×105個細胞接種至6 孔板中，按成脂誘導分化培養基試劑盒說明書對BMSCs 進行誘導處理，將完全培養基吸走后，每孔加入2 mL OriCell 大鼠骨髓間質干細胞成脂誘導分化培養基A 液（由基礎培養基175 mL、胎牛血清20 mL、雙抗2 mL、谷氨酰胺2 mL、胰島素400 μL、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤200 μL、羅格列酮200 μL、地塞米松200 μL 組成），誘導3 d 后，吸走A 液，加入2 mL B 液（由基礎培養基175 mL、胎牛血清20 mL、雙抗2 mL、谷氨酰胺2 mL、胰島素400 μL 組成）；24 h 后，吸走B 液，換回A液進行誘導；A 液和B 液交替作用6 次后，繼續用B 液維持培養5 d 直到脂滴變得大和圓；多聚甲醛固定，進行油紅O 染色，于顯微鏡下觀察成脂染色效果。

2.6 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 水平遷移能力的影響

將BMSCs 以1×105/孔接種至6 孔板中，培養至細胞鋪滿孔后，在鋪滿細胞的六孔板底部中間采用1 mL 無菌槍頭劃1 條直線，用PBS 洗去劃痕中間漂浮的細胞，保證劃痕區域無細胞存在。設置對照組，Verteporfin（2、5 μmol/L）組，5%含藥血清組，5%含藥血清＋Verteporfin（2 μmol/L）組和5%含藥血清＋Verteporfin（5 μmol/L）組。各給藥組分別加入相應藥物，對照組加入DMSO，隨即在倒置顯微鏡下觀察并拍照劃痕的情況，培養24 h 后在顯微鏡下觀察并拍照劃痕愈合的情況。

2.7 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 垂直遷移能力的影響

按“2.6”項下方法進行分組，Transwell 小室中加入100 μL 基礎培養基濕潤小室，24 孔板的下層分別加入 600 μL 含有相應藥物的培養基。BMSCs 消化離心，棄上清，用無血清培養基重懸，以2×105/mL 接種于小室上層，培養24 h 后，取出小室，PBS 清洗2 次；用甲醇固定30 min，PBS 清洗2 次；結晶紫染色5 min，PBS 清洗，用棉簽擦去小室上層未能穿過薄膜的細胞，于顯微鏡下觀察并拍照遷移后的細胞。

2.8 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 中LATS2、YAP 和CTGF 蛋白表達的影響

BMSCs 胰酶消化后計數，將2×105個細胞接種至6 孔板中，培養12 h。設置對照組和含藥血清（2.5%、5.0%）組，各給藥組加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養基，培養24 h，收集細胞，加入細胞裂解液，離心取上清液，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入LATS2抗體（1∶1000）、YAP 抗體（1∶1000）、CTGF 抗體（1∶1000）和β-actin 抗體（1∶2000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，分別加入山羊抗兔抗體（1∶1000）、山羊抗小鼠抗體（1∶2000），室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，加入ECL 化學發光液顯影。

2.9 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件分析數據，計量資料以x s± 表示，采用t檢驗或單因素方差分析。

3 結果

3.1 大鼠原代BMSCs 的鑒定

如圖1-A 所示，BMSCs 分離后正常貼壁生長，鏡下可見細胞呈長梭形。如圖1-B 所示，經成骨誘導茜素紅染色后，可見大量被染成紅色的礦化結節。如圖1-C 所示，經成脂誘導油紅-O 染色后，可見大量被染成橘紅色的脂滴。如圖1-D～G 所示，表達CD29 的陽性率為99.68%，表達CD44 的陽性率為99.03%，表達CD45 的陽性率為0.14%，CD90 的陽性率為95.38%，符合BMSCs 的特征。以上結果表明提取的細胞為BMSCs，可以確保后續研究中細胞來源的準確性。

圖1 大鼠原代BMSCs 的形態 (A)、礦化結節形成 (B)、脂滴形成 (C) 以及CD29 (D)、CD44 (E)、CD45 (F) 和CD90 (G) 表面標記物表達情況Fig.1 Morphology (A) of primary rat BMSCs, mineralized nodule formation (B), lipid droplet formation (C) and expressions of surface markers of CD29 (D), CD44 (E), CD45 (F) and CD90 (G)

3.2 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 水平遷移能力的影響

低表達LATS1 抑制Hippo 信號通路可以促進間充質干細胞的遷移[8]，YAP 作為Hippo-YAP 信號通路中的效應基因，可能是調控BMSCs 遷移的重要蛋白。如圖2 所示，與對照組比較，YAP 抑制劑Verteporfin 顯著抑制BMSCs 遷移（P＜0.01、0.001），5%含藥血清顯著促進BMSCs 遷移（P＜0.05）；與等劑量的Verteporfin 組比較，5%含藥血清＋Verteporfin組BMSCs 遷移率顯著升高（P＜0.01、0.001）。

圖2 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 水平遷移能力的影響Fig.2 Effect of Verteporfin and Longbie Capsules containing serum on horizontal migration of BMCSs

3.3 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 垂直遷移能力的影響

如圖3 所示，與對照組比較，Verteporfin 顯著 抑制BMSCs 遷移（P＜0.05），5%含藥血清顯著促進BMSCs 遷移（P＜0.05）；與等劑量的Verteporfin組比較，5%含藥血清＋Verteporfin 組BMSCs 遷移數顯著升高（P＜0.01）。

圖3 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 垂直遷移能力的影響Fig.3 Effect of Verteporfin and Longbie Capsules containing serum on vertical migration of BMCSs

3.4 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 中LATS2、YAP 和CTGF 蛋白表達的影響

如圖4 所示，與對照組比較，含藥血清（2.5%、5.0%）組細胞LATS2 蛋白表達水平顯著降低（P＜ 0.05），YAP、CTGF 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），表明龍鱉膠囊具有調節Hippo-YAP 信號通路的作用。

圖4 Verteporfin 和龍鱉膠囊含藥血清對BMCSs 中LATS2、YAP 和CTGF 蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Verteporfin and Longbie Capsules containing serum on expressions of LATS2, YAP and CTGF in BMCSs

4 討論

關節軟骨損傷是發生OA 等關節退行性慢性疾病的主要病理因素，因關節軟骨自愈能力較差，受損后無法完成自行修復，最終引起關節功能性障礙，嚴重影響患者的生活質量[14]。傳統的關節軟骨修復方法不能形成類似于天然透明軟骨組織的結構和生物力學性能，自體軟骨細胞移植技術雖然可以生成生物力學性能良好的透明軟骨樣組織，改善患者癥狀和恢復運動功能[15]，但存在供體部位損傷、分離的軟骨去分化等問題[16]。BMSCs 移植在關節軟骨修復治療中備受關注，其在特定條件下可以分化為軟骨細胞，且移植后能夠與軟骨下骨板融合，是修復關節軟骨的理想細胞[17]。BMSCs 同樣具有較強的遷移和歸巢能力，當機體組織出現損傷后，MSCs被損傷部位所召喚后復蘇，定向遷移至損傷處并進行多向分化，從而對損傷細胞和組織進行修補[6]。遷移及歸巢能力有助于BMSCs 成功定植于損傷部位，因此促進BMSCs 向受損的組織定向遷移是其發揮軟骨修復作用的關鍵環節。本研究通過全骨髓貼壁培養法培養大鼠BMSCs，利用成骨、成脂分化和細胞表面標記物等方法鑒定細胞，結果表明提取的細胞分別被成功誘導出礦化結節和脂肪滴，且細胞表面標記物CD29、CD44 和CD90 為陽性表達，CD45 為陰性表達，符合BMSCs 的表型。

Hippo-YAP 信號通路主要由核心分子LATS1/2和哺乳動物不育系20 樣激酶1/2（mammalian sterile 20-like kinase1/2，MST1/2）、效應分子YAP 以及轉錄共刺激因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）組成，是調控組織、細胞分化和增殖的重要通路，其多種配體、受體、轉錄調控因子、激酶以及轉錄因子在MSCs 中均有表達[8]。通過調控Hippo-YAP 信號通路可能會影響BMSCs 的增殖、分化、遷移等生物學功能[9]，從而調控成軟骨分化的功能。通過敲低LATS1 可以抑制Hippo 信號通路，降低YAP 磷酸活性，增強YAP轉錄活性，進而提高小鼠BMSCs 在體外的增殖和遷移能力[10]。YAP 作為Hippo-YAP 信號通路中的效應基因，其活性對BMSCs 分化作用尤為重要。在YAP 缺陷的 BMSCs 中，細胞核 β-連環蛋白（β-catenin）表達水平明顯降低，Wnt/β-catenin 信號通路活性減弱，BMSCs 成骨分化功能受限[18]；YAP也是人臍帶MSCs 成脂、成骨分化的關鍵調控因子，通過上調YAP，可以誘導臍帶MSCs 向成骨細胞的分化[19]，表明YAP 是BMSCs 成骨分化重要的調節基因。但YAP 對BMSCs 遷移的作用尚不明確，因此，本研究考察了YAP 抑制劑Verteporfin 對BMSCs遷移的影響，結果表明Verteporfin 能夠抑制BMSCs遷移。

補腎活血中藥能夠有效緩解OA 患者疼痛和改善關節功能[20-21]。龍鱉膠囊以補腎活血為治療原則，對OA 具有較好的療效[22]；龍鱉膠囊能夠修復OA大鼠的關節軟骨[23]，促進BMSCs 增殖[13]，且與BMSCs 聯用對OA 的治療效果更為顯著[12]。因此，龍鱉膠囊可能通過調控BMSCs 遷移從而發揮促進關節軟骨修復的作用。本研究結果顯示，龍鱉膠囊含藥血清具有促進BMSCs 遷移的作用，與等劑量的Verteporfin 比較，龍鱉膠囊含藥血清＋Verteporfin顯著促進細胞遷移，表明龍鱉膠囊含藥血清能夠阻斷Verteporfin 抑制的BMSCs 遷移；與對照組比較，龍鱉膠囊含藥血清顯著抑制LATS2 蛋白表達水平，上調YAP 和CTGF 蛋白表達水平。

綜上，YAP 抑制劑Verteporfin 具有抑制BMSCs遷移的功能，龍鱉膠囊含藥血清能夠阻斷這一過程，從而起到增強BMSCs 遷移能力的作用，其作用機制可能與調控Hippo-YAP 信號通路相關。細胞遷移功能與BMSCs 歸巢、分化及其組織修復能力密切相關，本課題組后續將研究龍鱉膠囊調控BMSCs成軟骨分化的作用及機制，為探索補腎活血中藥修復關節軟骨提供新的研究方向和思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突