基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究清熱利膽湯治療膽汁瘀積性肝損傷的作用機(jī)制

黃 彭，曲佳琳，段文倩，韋天夫1,，張 洋，蔡明宸，張雪揚(yáng)，張桂信，冷愛晶,*

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合臨床重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116011

2.大連醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，遼寧 大連 116044

3.河南睢縣人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 商丘 476900

4.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中藥科，遼寧 大連 116011

5.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌與代謝病科，遼寧 大連 116011

6.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合普外科，遼寧 大連 116011

膽汁瘀積性肝損傷是由膽汁分泌和排泄受阻引起的病理過程，可能與肝內(nèi)外膽管病變有關(guān)。正常情況下，膽汁排入腸道；當(dāng)膽汁排泄受阻時(shí)，引起吸收不良、營(yíng)養(yǎng)不良和骨骼改變[1]，瘀積的膽汁會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，長(zhǎng)期的膽汁瘀積引起肝纖維化甚至肝硬化[2]。膽汁瘀積分為肝內(nèi)膽汁瘀積和肝外膽汁瘀積。目前，肝外膽汁瘀積癥需要盡早行內(nèi)鏡或手術(shù)治療。研究表明，膽內(nèi)膽汁瘀積與膽汁酸代謝途徑中的鈉-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sodium- taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）、膽汁酸鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、多藥耐藥蛋白2（multidrug resistance associated protein 2，MRP2）、MRP3 等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)[3]。

清熱利膽湯為大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院協(xié)定處方，由金錢草、黃芩、枳殼、木香、梔子、大黃組成，具有清熱、利濕、退黃的功效，廣泛用于治療膽囊炎、膽石癥等疾病，臨床療效較好[4]。目前，清熱利膽湯治療膽汁瘀積性肝損傷的作用機(jī)制尚未見報(bào)道，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[5-6]方法系統(tǒng)分析清熱利膽湯治療膽汁瘀積性肝損傷的作用機(jī)制，并通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 膽汁瘀積性肝損傷候選靶點(diǎn)的確定 以“膽汁瘀積性肝損傷”為關(guān)鍵詞，在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）和NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）進(jìn)行檢索，獲得膽汁瘀積性肝損傷相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.2 化合物篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 本課題組前期采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC- QTOF-MS）法，初步鑒定了清熱利膽湯中72 種成分[7]，依據(jù)“類藥五原則”進(jìn)行篩選：相對(duì)分子質(zhì)量≤500、油水分配系數(shù)≤5、氫鍵供體數(shù)≤5、氫鍵受體數(shù)≤10。此外，黃芩苷、漢黃芩苷、蘆丁等成分雖然在類藥五原則之外，但經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道具有較好的生物活性，合并此類化合物。從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/）和 SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（ http://www.swisstargetprediction.ch/）收集各活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）分析 采用Cytoscape 3.2.1 軟件將成分靶點(diǎn)映射到疾病靶點(diǎn)，取交集靶點(diǎn)作為潛在作用靶點(diǎn)；采用STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析，采用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.1.4 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用DAVID 在線分析工具對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析[8]，采用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并利用Network Analyzer 插件對(duì)其拓?fù)涮匦赃M(jìn)行分析，確定關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)。

1.1.5 分子對(duì)接 利用SYBYL-X2.0 軟件對(duì)潛在作用靶點(diǎn)和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。從RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.pdb.org/）下載候選蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得活性成分的二維結(jié)構(gòu)文件，通過去水、加氫、轉(zhuǎn)換格式，得到活性成分和靶點(diǎn)的結(jié)合分?jǐn)?shù)，對(duì)接得分≥5 表明活性成分與靶蛋白具有較好的結(jié)合作用。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠28 只，8 周齡，體質(zhì)量280 g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（遼）2018-0003）。動(dòng)物飼養(yǎng)于大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±1）℃、濕度（65±5）%、光暗循環(huán)12 h，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)AE18015）。

1.2.2 藥材 金錢草（批號(hào)170301）、黃芩（批號(hào)170505）、枳殼（批號(hào)170305）、木香（批號(hào)170503）、梔子（批號(hào)170305）、大黃（批號(hào)160702）由大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥局冷愛晶教授鑒定分別為報(bào)春花科植物過路黃Lysimachia christinaeHance 的干燥全草、唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根、蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)、菊科植物木香Aucklandia lappaDecne.的干燥根、茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果實(shí)、藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根及根莖。

1.2.3 藥品與試劑 RNA 提取試劑盒（批號(hào)AJ12064A）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)AJ10742A）、SYBR Green染料試劑盒（批號(hào)AJE1687A）購(gòu)自日本Takara公司；注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸（思美泰，批號(hào)16186TB23）購(gòu)自上海雅培制藥有限公司；蛋白激酶C α（protein kinase C α，PRKCA）、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（protooncogene serine/ threonine-protein kinase 1，RAF1）、雙特異性絲裂原活化蛋白激酶1（dual specificity mitogen-activated protein kinase 1，MAP2K1）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由大連寶生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2.4 儀器 7180 型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；PCR 反轉(zhuǎn)錄儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；ABI 7500 型qRT-PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystem 公司）；顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2.5 清熱利膽湯的制備 稱取金錢草30 g、黃芩15 g、木香15 g、枳實(shí)15 g、梔子15 g、大黃10 g，將除大黃外的藥材于10 倍量的水中浸泡1 h，加熱回流1 h，經(jīng)6 層吸水紗布濾過；向殘留物中加入8倍量的水，煮沸30 min；加入大黃，再煮沸30 min，經(jīng)6 層吸水紗布濾過；合并2 次濾液，真空濃縮至100 mL（以生藥量計(jì)，相當(dāng)于1 g/mL），本課題組前期采用UHPLC 法對(duì)清熱利膽湯進(jìn)行了分析[7]，通過直接與對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜相比較，鑒定了沒食子酸、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、兒茶素和原酸等23 個(gè)化合物；對(duì)于沒有對(duì)照品的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量誤差在1×10?5以內(nèi)的化合物，參考同位素豐度和文獻(xiàn)中的裂解模式，根據(jù)[M－H]?、[M＋HCOO]?、[M＋H]+和[M＋Na]+等準(zhǔn)分子離子峰確定分子式。

1.2.6 造模、分組與給藥 SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、思美泰（50 mg/kg）組和清熱利膽湯（8 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量）組，每組7 只。模型組和各給藥組大鼠ip 戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉，分離膽總管，用4.0 絲線在近端和遠(yuǎn)端結(jié)扎膽總管，建立膽汁瘀積性肝損傷模型[9]，術(shù)后im 酮洛芬（3 mg/kg）鎮(zhèn)痛[10]；對(duì)照組大鼠只分離膽總管，不進(jìn)行結(jié)扎。思美泰溶于純水配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的溶液，術(shù)后3 d，思美泰組im 2 mL 藥物，清熱利膽湯組ig 2 mL 藥物，對(duì)照組和模型組ig 等體積0.9%氯化鈉溶液，1 次/d，連續(xù)2 周。

1.2.7 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性以及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）和總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平的影響給藥結(jié)束后，各組大鼠ip 戊巴比妥（50mg/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中AST、ALT活性以及TBIL、DBIL 和TBA 水平。

1.2.8 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 大鼠脫頸椎處死，分離肝組織，于10%福爾馬林中固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片（厚5 μm），進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

1.2.9 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠肝組織PRKCA、RAF1、MAP2K1、MAPK1mRNA 表達(dá)的影響 按照試劑盒說明書提取各組大鼠肝組織中總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 分析。引物序列：PRKCA上游引物 5’-TCCAGGATGACGAC- GTGGAG-3’，下游引物5’-CGTTGACGTATTCCAT- GACGAAG-3’；RAF1上游引物5’-CATCATCCACA- GAGACATGAAATCC-3’，下游引物5’-TCAACCT- GCTGAGAACCACTCC-3’；MAP2K1上游引物5’-AGCTAATTGACTCCATGGCCAAC-3’，下游引物 5’-TGGCATCCAAACAGCAGCTC-3’；MAPK1上游引物5’-ATGCTGTCATTTGTCATGCTGTG-3’，下游引物5’-CAGAACTGTCTGGAGTGCTCTGAA-3’；GAPDH上游引物5’-GGCACAGTCAAGGCTGAG- AATG-3’，下游引物5’-ATGGTGGTGAAGACGCC- AGTA-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)間的兩兩比較采用單因素方差分析和LSD 方法，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 利用Gene Cards 和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)共得到686 個(gè)與膽汁瘀積性肝損傷相關(guān)的疾病靶點(diǎn)；共篩選得到清熱利膽湯中的49 個(gè)活性成分，見表1。利用Cytoscape 3.2.1 軟件將成分靶點(diǎn)映射到疾病靶點(diǎn)，獲得125 個(gè)交集靶點(diǎn)。以交集靶點(diǎn)作為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，采用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖1。PPI 網(wǎng)絡(luò)包含124 個(gè)節(jié)點(diǎn)、2249 個(gè)邊，節(jié)點(diǎn)大小代表度值的高低，靶點(diǎn)的重要性與度值呈正相關(guān)，清熱利膽湯可能通過作用于胰島素（insulin，INS）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonine-protein kinase，AKT1）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL6）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、半胱氨酸蛋白酶9（Caspase 9，CASP9）、MAPK1、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）等靶點(diǎn)，從而治療膽汁瘀積性肝損傷。

表1 清熱利膽湯中活性成分的類藥五原則信息Table 1 Information of Lipinski rule related active compound in Qingre Lidan Decoction

續(xù)表1

圖1 清熱利膽湯治療膽汁瘀積性肝損傷靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.1 PPI network of targets of Qingre Lidan Decoction in treatment of cholestatic liver injury

2.1.2 KEGG 通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)124 個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共獲得34 條通路，涉及84 個(gè)靶點(diǎn)，刪除不相關(guān)的通路，如圖2 所示。“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖3， 由168 個(gè)節(jié)點(diǎn)和765 條邊組成。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析顯示，前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、磷脂酰肌醇3-激酶p110 γ（ phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit γ isoform，PI3KCG）、AKT1、TNF、MAPK1、PRKCA 和CASP3 等靶點(diǎn)具有較高的度值，PI3K-Akt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等具有較高的度值，表明清熱利膽湯可能通過以上靶點(diǎn)及通路治療膽汁瘀積性肝損傷。PRKCA 和MAPK1 具有較高的度值，參與了MAPK等信號(hào)通路；RAF1、MAP2K1 和MAPK1 是MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵連接點(diǎn)，將這些靶點(diǎn)映射到成分，發(fā)現(xiàn)原花青素B2、槲皮素與MAP2K1 和MAPK1關(guān)聯(lián)，PRKCA 與毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、梔子苷、京尼平苷、原花青素B2、原兒茶酸、槲皮素、山梔苷關(guān)聯(lián)，RAF1 與柚皮苷、槲皮素關(guān)聯(lián)。

圖2 KEGG 通路富集分析Fig.2 KEGG pathway enrichment analysis

圖3 “成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.3 “Component-target-pathway-disease” network

2.1.3 分子對(duì)接結(jié)果分析 如圖4 所示，原花青素B2和MAP2K1 對(duì)接得分為9.16，槲皮素和MAPK1對(duì)接得分為5.83，具有較高的結(jié)合活性，陽(yáng)性對(duì)照藥物思美泰與PRKCA、MAP2K1、MAPK1、RAF1的對(duì)接得分分別為5.06、7.64、7.87、4.40；部分成分與靶點(diǎn)的對(duì)接構(gòu)象見圖5。

圖4 清熱利膽湯中活性成分、思美泰與靶點(diǎn)的分子對(duì)接得分Fig.4 Docking total score of active compounds in Qingre Lidan Decoction, Simeite and targets

圖5 活性成分與靶點(diǎn)的對(duì)接構(gòu)象Fig.5 Docking conformations of compounds and targets

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠血清中AST、ALT 活性以及TBIL、DBIL 和TBA 水平的影響 如圖6 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT 活性以及TBIL、DBIL 和TBA水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，清熱利膽湯組大鼠血清中ALT 活性和TBA 水平明顯降低（P＜0.05），思美泰組大鼠血清中AST、ALT 活性以及TBIL、DBIL 和TBA 水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖6 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠血清中AST、ALT 活性以及TBA、TBIL 和DBIL 水平的影響 ( ± s, n = 7)Fig.6 Effect of Qingre Lidan Decoction on activities of AST, ALT and levels of TBA, TBIL and DBIL in serum of cholestatic liver injury rats ( ± s, n = 7)

2.2.2 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 如圖7 所示，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞及肝內(nèi)膽管區(qū)結(jié)構(gòu)正常；模型組出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管增生、靜脈擴(kuò)張、瘀血、肝 竇擴(kuò)張、肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡以及明顯的膽汁瘀積現(xiàn)象；各給藥組肝組織損傷不同程度地改善，膽汁瘀積和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減輕，膽管區(qū)結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰。

圖7 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響Fig.7 Effect of Qingre Lidan Decoction on pathological changes of liver tissue in cholestatic liver injury rats

2.2.3 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠肝組織PRKCA、RAF1、MAP2K1和MAPK1mRNA 表達(dá)的影響 如圖8 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中PRKCA和MAPK1mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01），RAF1mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中PRKCA、MAP2K1和MAPK1mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），RAF1mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

圖8 清熱利膽湯對(duì)膽汁瘀積性肝損傷大鼠肝組織PRKCA、RAF1、MAP2K1、MAPK1 mRNA 表達(dá)的影響 ( ± s, n = 7)Fig.8 Effect of Qingre Lidan Decoction on mRNA expressions of PRKCA, RAF1, MAP2K1 and MAPK1 in liver tissue of cholestatic liver injury rats ( ± s, n = 7)

3 討論

肝臟是人體重要的代謝器官，容易受多種因素影響。膽汁酸主要在肝臟合成和代謝，在肝細(xì)胞的基底膜和肝細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。肝內(nèi)膽汁瘀積導(dǎo)致膽汁酸生成、吸收和流動(dòng)障礙[12]。肝臟中膽汁酸過度滯留，會(huì)導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至肝衰竭[2]。中醫(yī)認(rèn)為膽汁瘀積癥屬于濕熱范疇，應(yīng)遵循清熱、祛濕、解黃的治療原則。清熱利膽湯是根據(jù)上述病機(jī)，且臨床有效的經(jīng)典協(xié)定處方，已經(jīng)廣泛用于治療肝膽系疾病。本研究基于前期化學(xué)成分表征，運(yùn)用網(wǎng) 絡(luò)藥理學(xué)和分子生物學(xué)方法，探究清熱利膽湯治療膽汁瘀積性肝損傷的作用機(jī)制。

PPI 分析顯示，清熱利膽湯可能通過作用于INS、AKT1、IL6、TP53、TNF、VEGFA、CASP9、CXCL8、MMP9 和MAPK1 等靶點(diǎn)治療膽汁瘀積性肝損傷。PRKCA 下游靶蛋白R(shí)AF1、MAP2K1 和MAPK1 是MAPK 信號(hào)通路的關(guān)鍵連接點(diǎn)。PRKCA通過調(diào)節(jié)RAF1、B 淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl2）、硫酸軟骨素蛋白多糖4（chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4）、肌鈣蛋白T（troponin T，TNNT2）或激活MAPK1 信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移和黏附、腫瘤發(fā)生、心肌肥大、血管生成、血小板功能和炎性反應(yīng)[13]。研究表明，蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）與膽汁瘀積癥有關(guān)[14-15]；激活MAPK1 會(huì)引起低滲細(xì)胞的腫脹反應(yīng)，促進(jìn)膽汁酸排泄[16]；調(diào)節(jié)MAP2K1 為防止過量膽汁酸促癌作用的新靶點(diǎn)[17]；RAF1 的激活會(huì)啟動(dòng) MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)（包括 MAP2K1、MAPK1）[18]。

原花青素B2是大黃中的黃酮類成分，槲皮素是黃芩、金錢草中的黃酮類成分，體內(nèi)外均具有較好的肝保護(hù)活性[19-20]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，原花青素B2和MAP2K1、槲皮素和MAPK1 結(jié)合能力較好。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中PRKCA、MAP2K1、MAPK1mRNA 表達(dá)水平升高，RAF1mRNA 表達(dá)水平降低；各給藥組大鼠肝組織中PRKCA、MAP2K1、MAPK1mRNA 表達(dá)水平降低，RAF1mRNA 表達(dá)水平升高。

綜上，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)清熱利膽湯可能通過調(diào)節(jié)PRKCA、MAP2K1、MAPK1、RAF1 等靶點(diǎn)，從而治療膽汁瘀積性肝損傷（圖9）。

圖9 清熱利膽湯治療膽汁瘀積性肝損傷的作用機(jī)制Fig.9 Mechanism of Qingre Lidan Decoction in treatment of cholestasis liver injury

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突