黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生、平滑肌細胞表型轉化和增殖的影響

李 霞，曹 旺，劉彩霞，鄧常清,*

1.湖南中醫藥大學 中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410028

2.湖南中醫藥大學 血管生物學實驗室，湖南 長沙 410028

血管內膜增生（intimal hyperplasia，IH）是多種心血管疾病的基本病理機制[1-2]。IH 是一種獨特的血管重塑狀態，涉及內皮細胞損傷、成纖維細胞激活、細胞外基質重建以及血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）遷移、增殖和分化等血管的所有組成部分。VSMC 遷移至血管內膜并不斷增殖，血管管腔逐漸縮小，為造成動脈粥樣硬化、冠狀動脈搭橋術、冠狀動脈支架置入術等血管狹窄的主要原因[3]。

黃芪和當歸藥對為臨床常用的氣血雙補藥對，也是常用的益氣活血藥對。黃芪味甘而薄，具補氣之功；當歸味甘而重，故專能補血，其氣輕而辛，故又能行血。黃芪-當歸配伍具有保護心血管[4]、抗動脈粥樣硬化、抗腦缺血、抗臟器纖維化等作用，可以干預血管內膜增生多個相關的病理機制[5-7]。本課題組前期研究表明，黃芪-當歸配伍能夠抑制大鼠血管內皮損傷誘導的血管內膜增生，其作用機制與抑制VSMC 增殖、炎性反應和細胞外基質沉積等有關[8]。目前對于黃芪-當歸配伍抗血管內膜增生的配伍形式、藥效物質基礎和作用機制尚不明確。由于中藥治療疾病具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，本課題組前期采用網絡藥理學方法，探討了黃芪-當歸配伍改善血管內膜增生的藥效物質基礎和可能的作用靶點，發現黃芪-當歸配伍可能通過20 個活性成分，作用于193 個潛在靶點，調控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitrogen-acitivated protein kinase，MAPK）、Ras等信號通路，從而發揮抗血管內膜增生的作用[9]。本研究以黃芪和當歸配伍益氣活血功效為基礎，以VSMC 功能為切入點，探討黃芪-當歸配伍抗血管內膜增生的作用，并從VSMC 表型轉化和增殖研究其作用機制，旨在揭示其抗血管內膜增生的有效配伍，為臨床合理應用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物

清潔級新西蘭兔，雌雄各半，3～4月齡，體質量2.0～2.5 kg，購自湖南中醫藥大學實驗動物中心，動物許可證號SCXX（湘）2020-0005。動物于清潔級動物實驗室適應性飼養1 周，溫度25 ℃、濕度45%～65%，自由進食飲水。動物實驗經湖南中醫藥大學醫學動物實驗倫理委員會批準（批準號LL219102002）。

1.2 藥材

黃芪、當歸由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科左亞杰教授鑒定分別為豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根、傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels 的干燥根，符合《中國藥典》2020年版規定。

1.3 藥品與試劑

阿托伐他汀鈣片（批號20190411B，10 mg/片）購自浙江樂普藥業有限公司；Masson 改良三色染色試劑盒（批號20190613）購自北京索萊寶科技有限公司；二步法免疫組化法試劑盒（批號2015G0115）、DAB 顯色試劑盒（批號K196721D）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PI3K 抗體（批號LS-C312573）購自美國LSBio 公司；Akt 抗體（批號bs69512）、磷酸化PI3K（p-PI3K）抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號GR3257713-3）、p-Akt 抗體購自英國Abcam 公司；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（批號10003678）、β-actin 抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG 抗體、HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體購自美國Proteintech 公司；骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體（批號NB110-89062）購自美國Novus 公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測試劑盒（批號 20201028）、三酰甘油（triglycerides，TG）檢測試劑盒（批號20101034）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測試劑盒（批號20200820）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）檢測試劑盒（批號20201024）購自南京建成生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號PQ0012）購自上海碧云天生物技術有限公司；PVDF 膜（批號IPV00010）、ECL 化學發光試劑盒（批號WBKLS0100）購自美國Millipore 公司。

1.4 儀器

石蠟切片機（英國Shado 公司）；光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；水平電泳儀、凝膠成像分析系統、蛋白電泳及轉膜設備（美國Bio-Rad 公司）；高速離心機（美國Beckman 公司）；低溫臺式高速離心機（赫西儀器裝備有限公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；脫色搖床（上海新波公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）。

2 方法

2.1 黃芪-當歸配伍和制備

本課題組前期研究表明，黃芪-當歸（1∶1）配伍時具有較好的抗血管內膜增生的作用[8]，而傳統的黃芪-當歸配伍（當歸補血湯）多為5∶1 配伍，因此本研究設置黃芪-當歸（1∶1）、黃芪-當歸（1∶5）、黃芪-當歸（5∶1）3 個比例的配伍。按以上比例分別取藥材，加入8 倍量水，回流提取1 h，濾過；再加入6 倍量水，回流提取1 h，濾過；再加入6倍量水，回流提取1 h，濾過；合并3 次濾液，真空減壓濃縮至1 g/mL（以生藥量計）。

2.2 造模、分組與給藥

新西蘭兔隨機分為對照組、模型組、黃芪（1 g/kg）組、當歸（1 g/kg）組、黃芪-當歸（1∶1，2 g/kg）組、黃芪-當歸（1∶5，6 g/kg）組、黃芪-當歸（5∶1，6 g/kg）組和阿托伐他汀（5 mg/kg）組，每組10 只。按頸總動脈套管法改良制備頸總動脈血管內膜增生模型[10]，新西蘭兔術前12 h 禁食不禁水，耳緣iv 2.5%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉，仰臥固定，頸部正中切口，分離兩側頸總動脈；將1個無活性的柔軟的硅橡膠管（長20 mm、內徑1.0 mm）沿長軸剪開后，套在分離的兩側頸總動脈外面，用絲線結扎固定；術后im 青霉素，1 次/d，連續7 d。對照組只分離頸總動脈，不進行血管套管。自術后第1 天起喂養高脂飼料（2%膽固醇＋3%橄欖油＋95%普通飼料），對照組喂養普通飼料。自術后第1 天起，各給藥組ig 相應藥物，對照組和模型組ig 等體積蒸餾水（15 mL/kg），1 次/d，連續28 d。

2.3 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的影響

給藥結束后，新西蘭兔腹主動脈采血，3000 r/min 離心15 min，取上層血清，按試劑盒說明書測定血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平。

2.4 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈病理變化的影響

新西蘭兔腹主動脈采血后，取損傷段頸總動脈，在PBS 中將血管剝離干凈，于4%多聚甲醛中固定7 d，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，每段血管間斷均勻切取8 片（厚4～6 μm）；按試劑盒說明書進行Masson 染色，于顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定中膜面積（media area，MA）、內膜面積（intimal area，IA）、內膜中線周長、中膜中線周長，計算中膜厚度（media thickness，MT）、內膜厚度（intimal thickness，IT）、內膜面積增生率（hyperplasia ratio of intimal area，HRIA）、內膜厚度增生率（hyperplasia ratio of intimal thickness，HRIT），評價血管內膜增生程度。

MA＝外彈力膜內面積－內彈力膜內面積

IA＝內彈力膜內面積－管腔面積

MT＝(外彈力膜內面積/π)1/2－(內彈力膜內面積/π)1/2

IT＝(外彈力膜內面積/π)1/2－(管腔面積/π)1/2

HRIA＝內膜面積/(內膜面積＋中膜面積)

HRIT＝內膜厚度/(內膜厚度＋中膜厚度)

2.5 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈α-SMA、OPN 和PCNA 表達的影響

免疫組化法測定損傷段頸總動脈增生內膜中VSMC 收縮表型標志物α-SMA、合成表型標志物OPN 和增殖標志物PCNA 表達。取各組損傷段頸總動脈，于4%多聚甲醛中固定7 d，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（厚4 μm）；60 ℃烤片過夜，脫蠟水化，微波抗原修復，冷卻至室溫，分別滴加50 μL α-SMA 抗體（1∶2000）、PCNA 抗體（1∶300）、OPN 抗體（1∶300），4 ℃孵育過夜；滴加HRP 標記的山羊抗小鼠/兔IgG 抗體，37 ℃孵育30 min；DAB 顯色，蘇木素復染，脫水、透明后封片，于顯微鏡下觀察并拍照，陽性表達呈棕黃色點狀或纖維狀染色，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定吸光度（A）值并計算陽性染色面積。

2.6 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響

取各組損傷段頸總動脈，加入RIPA 裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，100 ℃加熱變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉90 min；分別加入PI3K 抗體（1∶1000）、p-PI3K抗體（1∶500）、Akt 抗體（1∶1000）、p-Akt 抗體（1∶1000）和β-actin 抗體（1∶5000），4 ℃孵育過夜；加入HRP 標記的山羊抗小鼠/兔IgG 抗體（1∶1000），室溫孵育90 min；加入ECL 化學發光液顯影，采用Image J 軟件分析條帶。

2.7 統計學方法

數據以±s表示，采用SPSS 23.0 軟件進行統計分析。先將各組數據進行正態性、方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者用LSD檢驗；方差不齊者用Dunnett’sT3 檢驗。

3 結果

3.1 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的影響

如表1 所示，與對照組比較，模型組家兔血清中TC、TG 和LDL-C 水平顯著升高（P＜0.01），HDL-C 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪-當歸（1∶1、5∶1）組及阿托伐他汀組血清中TC、TG 和LDL-C 水平顯著降低（P＜0.05、0.01），HDL-C 水平顯著升高（P＜0.01）；當歸組血清中TG 和LDL-C 水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

表1 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的影響 ( ± s , n=5)Table 1 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on levels of TC, TG, LDL-C and HDL-C in serum of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

表1 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型血清中TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的影響 ( ± s , n=5)Table 1 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on levels of TC, TG, LDL-C and HDL-C in serum of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01，下表同*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; △P < 0.05 △△P < 0.01 vs model group, same as below tables

組別 劑量/(g·kg?1) TC/(mmol·L?1) TG/(mmol·L?1) HDL-C/(mmol·L?1) LDL-C/(mmol·L?1) 對照 — 2.95±0.41 0.64±0.05 4.49±0.13 0.52±0.18 模型 — 64.24±13.12** 6.39±1.55** 0.87±0.05** 15.83±3.34** 黃芪 1 53.56±11.60 5.13±1.37 0.64±0.26 18.57±3.94 當歸 1 50.31±8.88 3.98±0.91△△ 0.54±0.31 11.94±2.62△ 黃芪-當歸（1∶1） 2 25.92±10.02△ 2.91±0.98△△ 4.30±1.83△△ 6.11±1.97△△ 黃芪-當歸（1∶5） 6 54.90±10.02 6.22±1.32 1.27±0.60 15.12±2.25 黃芪-當歸（5∶1） 6 29.15±2.85△ 2.38±0.73△△ 6.16±3.44△△ 6.53±1.65△ 阿托伐他汀 0.005 9.04±2.44△△ 2.11±0.62△△ 5.95±1.31△△ 2.87±1.83△△

3.2 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈病理變化的影響

如圖1 所示，對照組家兔血管內彈力膜完整，呈單層，未見明顯增生；模型組血管內膜呈均一或不均一增厚，并有大量增生的VSMC 存在，排列紊亂，內膜增生明顯；各給藥組血管內膜呈增生性改變，但增生程度較模型組減輕。

圖1 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈病理變化的影響 (Masson, ×100)Fig.1 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on pathological changes of common carotid artery in vascular intimal hyperplasia rabbit model (Masson, × 100)

如表2 所示，與對照組比較，模型組IA、IT、HRIA、HRIT 均顯著升高（P＜0.01），表明兔頸總動脈不完全性狹窄后出現明顯的內膜增生；與模型組比較，黃芪-當歸（1∶1、5∶1）組及阿托伐他汀組IA、IT、HRIA、HRIT 均顯著降低（P＜0.01）。

表2 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈IA、IT、HRIA 和HRIT 的影響 ( ± s , n=5)Table 2 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on IA, IT, HRIA and HRIT of common carotid artery in vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

表2 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈IA、IT、HRIA 和HRIT 的影響 ( ± s , n=5)Table 2 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on IA, IT, HRIA and HRIT of common carotid artery in vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

組別 劑量/(g·kg?1) IA/μm2 IT/μm HRIA/% HRIT/% 對照 — 6 711.80±1 583.54 2.92±0.58 0.06±0.01 0.07±0.01 模型 — 43 150.40±10 544.20** 25.69±9.09** 0.35±0.03** 0.37±0.02** 黃芪 1 37 335.00±7 316.51 19.53±3.57 0.32±0.05 0.37±0.05 當歸 1 44 011.00±9 800.04 19.33±0.72 0.29±0.04 0.36±0.05 黃芪-當歸（1∶1） 2 15 493.00±5 119.52△△ 4.43±0.98△△ 0.18±0.06△△ 0.18±0.03△△ 黃芪-當歸（1∶5） 6 45 310.20±16 247.25 22.29±12.54 0.33±0.07 0.34±0.11 黃芪-當歸（5∶1） 6 11 904.60±9 971.65△△ 5.00±1.98△△ 0.23±0.08△△ 0.22±0.10△△ 阿托伐他汀 0.005 22 196.00±10 451.97△△ 7.12±3.19△△ 0.23±0.10△△ 0.20±0.09△△

3.3 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈α-SMA、OPN 和PCNA 表達的影響

α-SMA 是VSMC 的收縮表型標志物，能夠反映VSMC 的收縮狀態；OPN 是VSMC 合成表型標志物，能夠反映VSMC 的合成和分泌狀態；PCNA能夠反映VSMC 的增殖活性。如圖2～4 和表3 所示，與對照組比較，模型組頸總動脈α-SMA 表達顯著降低（P＜0.05），OPN 和PCNA 表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪-當歸（1∶1、5∶1）組及阿托伐他汀組頸總動脈α-SMA 表達顯著升高（P＜0.05、0.01），OPN 和PCNA 表達顯著降低（P＜0.01）；黃芪-當歸（1∶5）組頸總動脈PCNA 表達顯著降低（P＜0.01）。

圖2 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈α-SMA 表達的影響 (×200)Fig.2 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on α-SMA expression in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model (× 200)

圖3 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈OPN 表達的影響 (×200)Fig.3 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on OPN expression in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model (× 200)

3.4 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響

如圖5 所示，與對照組比較，模型組頸總動脈p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪-當歸（1∶1、1∶5、5∶1）組及阿托伐他汀組頸總動脈p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖4 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈PCNA 表達的影響 (×200)Fig.4 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on PCNA expression in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model (× 200)

圖5 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈PI3K/Akt 通路相關蛋白表達的影響 ( ± s , n=6)Fig.5 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on PI3K/Akt pathway related protein expressions in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=6)

表3 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈α-SMA、OPN 和PCNA 表達的影響 ( ± s , n=5)Table 3 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on expression of α-SMA, OPN and PCNA in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

表3 黃芪-當歸配伍對家兔血管內膜增生模型頸總動脈α-SMA、OPN 和PCNA 表達的影響 ( ± s , n=5)Table 3 Effect of Astragali Radix-Angelicae Sinensis Radix on expression of α-SMA, OPN and PCNA in common carotid artery of vascular intimal hyperplasia rabbit model ( ± s , n=5)

組別 劑量/(g·kg?1) α-SMA/μm2 OPN/μm2 PCNA/μm2 對照 — 0.40±0.05 0.22±0.02 0.24±0.03 模型 — 0.23±0.01* 0.33±0.02** 0.33±0.03** 黃芪 1 0.26±0.02 0.32±0.06 0.31±0.02 當歸 1 0.26±0.03 0.29±0 0.31±0.02 黃芪-當歸（1∶1） 2 0.39±0.03△△ 0.24±0.02△△ 0.23±0.01△△ 黃芪-當歸（1∶5） 6 0.25±0.03 0.30±0.03 0.29±0.03△△ 黃芪-當歸（5∶1） 6 0.38±0.05△ 0.21±0.01△△ 0.23±0.01△△ 阿托伐他汀 0.005 0.34±0.02△ 0.22±0.01△△ 0.24±0.03△△

4 討論

血管成形術后的6 個月內，55%患者會發生血管再狹窄[11]。血管成形術和支架植入后再狹窄主要由IH 引起，VSMC 活化在IH 的發生發展中具有重要的作用。當血管成形術和支架植入后，血管內皮受損，導致VSMC 由收縮表型向合成表型轉化，具有增殖、分化和合成的能力；VSMCs 由血管中膜向內膜遷移并增殖，并合成大量細胞外基質，導致血管內膜增生，管腔逐漸縮小[12-13]。中藥具有多環節、多靶點的調控作用，可以通過多成分調節血管內膜增生的病理機制，從而抑制或延緩血管內膜增生的發生發展。由于VSMC 遷移和增殖是血管內膜增生的主要病理機制，因此基于VSMC 功能來研究中藥防治血管內膜增生具有重要的意義。

本研究通過建立家兔頸總動脈血管內膜增生模型，考察黃芪和當歸不同比例配伍對血管內膜增生的作用，結果顯示，單用黃芪或當歸對血管內膜增生無顯著抑制作用，黃芪-當歸配伍能夠抑制兔血管內膜增生，黃芪和當歸不同配伍顯著降低IA、IT、HRIA、HRIT，其中黃芪-當歸（1∶1、5∶1）配伍的療效最佳，提示黃芪-當歸配伍具有抑制血管內膜增生的作用，以黃芪-當歸（1∶1、5∶1）配伍為宜。

血脂是誘發血管內膜增生的重要因素，高脂水平易引起機體代謝與功能紊亂，導致血管內皮受損、發生炎性反應及氧化損傷，從而直接或間接參與IH的病理過程[14]。血清炎性因子水平與血脂水平密切相關，調節血脂有助于改變機體的炎性反應[15]。研究表明，黃芪當歸合劑具有調脂作用，療效與他汀類藥物相似且更持久[16]。本研究結果顯示，單用黃芪對血脂水平無顯著影響，單用當歸僅降低TG 水平，黃芪-當歸（1∶1、5∶1）配伍能夠降低血清中TC、TG、LDL-C 水平，升高HDL-C 水平，表明黃芪-當歸配伍可能通過調節血脂水平，抑制脂質向血管壁沉積，從而抑制血管內膜增生。

VSMC 向血管內膜遷移和增殖在血管增生性疾病的發生發展中具有重要作用[17]。VSMC 是一種高度分化的細胞，可以形成血管壁的中層，通過收縮和舒張血管從而控制血壓。與其他終末分化的肌細胞不同，VSMC 保留了分化（或收縮）和去分化（或合成）表型之間相互轉換的獨特能力，能夠響應血管損傷、機械拉伸或生長因子刺激等生理和病理信號[18-20]。收縮型VSMC 呈細長的紡錘形形態，表現為極低的增殖活性，表達α-SMA、平滑肌22α（smooth muscle 22α，SM22α）等VSMC 特異性收縮基因。合成型VSMC 形態與成纖維細胞類似，體積較收縮型VSMC 大，其遷移、增殖活性增加，合成膠原、基質金屬蛋白酶等細胞外基質蛋白的能力增強，收縮基因的表達減少[19]，表達OPN、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等合成型標志物[21]。PCNA 是一種核蛋白，參與細胞增殖相關的DNA 合成，只在增殖細胞中合成和表達[22]。本研究結果顯示，模型組頸總動脈中VSMC 收縮表型的標志物α-SMA 表達降低，合成表型標志物OPN和細胞增殖標志物PCNA 表達升高，表明在血管狹窄模型中，VSMC 活化，由收縮表型向合成表型轉化增多，細胞向內膜遷移并增殖，促進新生內膜的形成；與模型組比較，單用黃芪或當歸對α-SMA、OPN 和PCNA 表達無明顯作用，黃芪-當歸（1∶1、5∶1）配伍能夠上調α-SMA 表達水平，下調OPN和PCNA 表達水平，提示黃芪-當歸配伍可以抑制VSMC 活化，抑制VSMC 由收縮型向合成型轉換和細胞增殖。

PI3K-Akt 信號通路是EGFR 下游信號通路的重要組成部分，在調節細胞周期、細胞生長、增殖和凋亡中發揮關鍵作用。PI3K/Akt 磷酸化激活是刺激VSMC 增殖和遷移的主要信號通路[23-25]。在血管內膜增生性疾病中，PI3K/Akt被激活，從而抑制VSMC收縮表型標記基因的表達[26-28]。本研究結果顯示，模型組頸總動脈中p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平顯著升高，表明PI3K/Akt 信號被激活；與模型組比較，黃芪-當歸（1∶1、5∶1）組p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達水平顯著降低，表明黃芪-當歸（1∶1、5∶1）配伍能夠抑制PI3K/Akt 信號通路，從而抑制VSMC增殖及表型轉化，發揮抗血管內膜增生的作用。

綜上所述，血管成形術后再狹窄的發生涉及血管重構、血管內膜增生、炎性反應、氧化應激、血管平滑肌細胞遷移和過度增殖等病理過程。黃芪-當歸配伍能夠調節血脂、抑制血管內膜增生、緩解管腔狹窄，其機制可能與抑制PI3K/Akt 信號通路、抑制VSMC 表型轉化和增殖有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突