基于數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及臨床觀察探究賈躍進(jìn)治療女性失眠癥用藥規(guī)律及機(jī)制

劉 毅，王瑞敏，彭雪峰，李 菲，趙 飛，劉 寧，賈躍進(jìn)

1.山西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，山西 太原 030024

2.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 科教科，山西 太原 030024

3.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)務(wù)科，山西 太原 030024

4.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 治未病中心，山西 太原 030024

失眠癥指以入睡困難、睡眠維持困難或早醒，并伴有疲勞、注意力不足和情緒不穩(wěn)定等日間功能障礙為主癥的疾病[1]，女性患病率約是男性的1.5倍[2]，通常被認(rèn)為是高血壓、糖尿病、抑郁癥、焦慮癥等軀體或精神疾病的危險因素[3-4]，故對女性群體有較大的危害。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雖然對失眠癥的相關(guān)研究取得了長足進(jìn)展，但仍無公認(rèn)的疾病模型，盡管有多種可選擇的治療藥物，但并無理想藥物[5-6]。而中醫(yī)學(xué)早在《內(nèi)經(jīng)》就已經(jīng)以“天人相應(yīng)”為基礎(chǔ)構(gòu)建了“營衛(wèi)”“陰陽”睡眠節(jié)律模型，并提出了失眠總病機(jī)，且中醫(yī)藥擅長治病求本，臨床應(yīng)用廣泛，具有安全、有效性，因此通過挖掘名老中醫(yī)治療女性失眠癥的經(jīng)驗(yàn)方則有利于中醫(yī)思想的傳承及相關(guān)藥物的研發(fā)，從而緩解患者痛苦、指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

賈躍進(jìn)是第六批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師，有40 余年的行醫(yī)經(jīng)驗(yàn)，在遍閱中醫(yī)經(jīng)典、熟稔各種方藥的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床形成了獨(dú)到的診療思路。以中醫(yī)《內(nèi)經(jīng)》理論為基礎(chǔ)，從“氣”的角度分析疾病，再以方對證、藥對癥的思路辨治，獲效甚眾。賈躍進(jìn)臨床尤擅治療失眠癥、抑郁癥、焦慮癥在內(nèi)的多種精神障礙以及調(diào)治亞健康狀態(tài)。鑒于當(dāng)前大數(shù)據(jù)環(huán)境下中醫(yī)藥臨床數(shù)據(jù)具有的“全數(shù)據(jù)”“知識密集型數(shù)據(jù)”的特點(diǎn)[7]，采用第四科研范式，即以數(shù)據(jù)驅(qū)動并將理論、計算機(jī)仿真和實(shí)驗(yàn)歸一的“數(shù)據(jù)密集型科學(xué)”的研究模式[7]，將有利于更好地把握研究探索的方向，發(fā)現(xiàn)并解決新的問題，本研究結(jié)合賈躍進(jìn)的臨床理論，采用數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和臨床驗(yàn)證的方法，從中醫(yī)數(shù)據(jù)的整體性、混雜性和相關(guān)聯(lián)系性出發(fā)，全面探索賈躍進(jìn)治療女性失眠癥的機(jī)制。

1 數(shù)據(jù)挖掘方法與結(jié)果

1.1 資料與方法

1.1.1 數(shù)據(jù)收集 收集山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院賈躍進(jìn)門診自2015年1月1日至2020年1月1日診斷為失眠癥的女性患者的資料及完善的病案。

1.1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》（CCMD-3）[8]明確診斷為失眠癥；年齡在20～65 歲的女性患者；單純口服中藥顆粒劑治療；結(jié)合比較治療前后匹茲堡及SPIEGEL 量表評分及隨訪判斷為有效；從治療前后進(jìn)行的基本檢查（血、尿常規(guī)、肝腎功能、心電圖等）判斷具有安全性。

（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：診斷和效果不明確、資料缺失或安全性存疑的病案；合并影響判斷的其他嚴(yán)重軀體及精神病者；干預(yù)方式非單純中藥或使用中藥其他劑型或使用中藥方式非口服者。

1.1.3 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、錄入與挖掘 通過納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，以雙人雙錄入法將篩選出的病案錄入至古今醫(yī)案云平臺V2.2.3 提供的模板中，確保準(zhǔn)確后使用其數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化模塊結(jié)合《中國藥典》2015年版[9]與《中藥學(xué)》第7 版[10]規(guī)范中藥名稱。獲得標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫后，使用數(shù)據(jù)挖掘模塊分別對其進(jìn)行藥物頻次、性味歸經(jīng)統(tǒng)計[9-10]，并通過關(guān)聯(lián)分析、聚類分析和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析獲得核心組方。

1.2 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

1.2.1 藥物頻次及屬性統(tǒng)計 共收集病案455 例，按納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選，獲得驗(yàn)案221 例。221 例驗(yàn)案包含方劑258 首，涉及中藥139 味，其中藥物應(yīng)用百分比大于20%的有19 味，見表1。將258 首方劑中139 味藥物進(jìn)行性味歸經(jīng)分析，結(jié)果以雷達(dá)圖（圖1）表示，其中中藥藥性分布為平、溫、微寒、寒；藥味為甘、辛、苦；藥物歸經(jīng)為肝、脾、心、肺、腎、胃經(jīng)。

表1 258 首處方藥物使用頻次及頻率 (頻率＞20%)Table 1 Frequency of drugs usage in 258 prescriptions (frequency ＞ 20%)

圖1 258 首處方中四氣 (左)、五味 (中)、歸經(jīng) (右) 頻次分布雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart of the frequency distributions of four characters (left), five tastes (middle), and channel tropism (right) in 258 prescriptions

1.2.2 藥物關(guān)聯(lián)分析、聚類分析、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析及核心組方確定 將258 首處方利用云平臺數(shù)據(jù)分析，設(shè)置置信度＞0.90，支持度＞0.35，得到20 組藥物關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，見表2；將藥物應(yīng)用頻率＞20%的19味中藥進(jìn)行聚類分析，同時設(shè)置距離類型為歐氏距離，聚類方法為最長距離法，可將其分為C1 類：川楝子、枳實(shí)、萊菔子；C2 類：麥芽、遠(yuǎn)志、黨參、半夏、陳皮；C3 類：香附、白術(shù)、茯苓、合歡皮；C4 類：龍骨、梔子、白茅根、柴胡、牡丹皮、白芍、當(dāng)歸4 個聚類處方，見圖2；最后設(shè)置節(jié)點(diǎn)度不小于150，進(jìn)行中藥-中藥復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，得到1 個由11味中藥組成的核心組方，見圖3。綜合以上并結(jié)合藥物頻次得出核心組方為茯苓、白術(shù)、合歡皮、柴胡、香附、白芍、龍骨、當(dāng)歸、牡丹皮、梔子、白茅根。

表2 258 首處方中藥物關(guān)聯(lián)分析 (置信度＞0.90，支持度＞0.35)Table 2 Association rule analysis of drugs in 258 prescriptions (confidence ＞ 0.90, support ＞ 0.35)

圖2 258 首處方中藥物聚類分析Fig.2 Cluster analysis of drugs in 258 prescriptions

圖3 258 首處方中藥物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析Fig.3 Complex network analysis of drugs in 258 prescriptions

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與結(jié)果

2.1 資料與方法

2.1.1 核心組方中藥物有效成分及對應(yīng)靶點(diǎn)篩選 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索核心組方中各藥物成分，并限定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、血腦屏障（blood brain barrier，BBB）≥?0.3、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，并匹配各成分靶點(diǎn)，對于無靶點(diǎn)記錄的有效成分則利用 SwissTargetPrediction 平臺（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測靶點(diǎn)，將 靶點(diǎn)在Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中匹配基因名。

2.1.2 疾病靶點(diǎn)獲取 在GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、Genecards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫中檢索“insomnia disorder”，得出失眠癥相關(guān)靶點(diǎn)，并將3 個數(shù)據(jù)庫所得失眠癥相關(guān)靶點(diǎn)合并、去重，再利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫篩選。

2.1.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲得 將各有效成分相關(guān)靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)利用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）平臺取交集，獲得核心組方中藥物的有效成分直接與疾病相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.1.4 疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)及蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以疾病、核心組方、各藥物、有效成分和相關(guān)靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，其相互關(guān)系為邊，在CytoscapeV3.8.0 中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并利用 MCODE 插件對 String 數(shù)據(jù)庫（ https:// string-db.org/）所得PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析。

2.1.5 基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因及基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 的BiNGO、ClueGO 插件分別進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，然后將其可視化。

2.1.6 關(guān)鍵有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接分析 根據(jù)節(jié)點(diǎn)度篩選“2.1.4”構(gòu)建的2 個網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵有效成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)分別在 Zinc（https://zinc.docking.org/）、PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中獲取3D 結(jié)構(gòu)，對于沒有結(jié)構(gòu)記錄的靶點(diǎn)則利用SWISS-MODEL 平臺（https://swissmodel.expasy.org/）模擬構(gòu)建其3D 結(jié)構(gòu)，然后使用Vina 分子對接，并選擇對接最好的組合使用Pymol 進(jìn)行可視化。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1 核心組方有效成分和對應(yīng)靶點(diǎn) 通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，結(jié)合SwissTargetPrediction 預(yù)測靶點(diǎn)，篩選出核心組方各藥物有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)。經(jīng)過去重、排除后，總計獲得有效成分65 種，重復(fù)成分5 種，相關(guān)靶點(diǎn)490 個。具體成分信息如表3所示。

表3 核心處方有效成分相關(guān)信息Table 3 Information of active ingredients of core prescription

續(xù)表3

2.2.2 疾病靶點(diǎn) 將GEO 數(shù)據(jù)庫得到的失眠癥相關(guān)數(shù)據(jù)集（編號GSE122541）使用R 語言進(jìn)行差異性分析，共得到100 個差異基因靶點(diǎn)，如圖4 所示；將GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到的2563個失眠相關(guān)基因按照相關(guān)度大于中位數(shù)進(jìn)行篩選，可獲得1074 個疾病靶點(diǎn)；此外OMIM 和TTD 分別得到295、28 個靶點(diǎn)。將以上所得靶點(diǎn)處理后，共計獲得失眠靶點(diǎn)1205 個。

圖4 GEO 數(shù)據(jù)集失眠癥差異基因分析結(jié)果Fig.4 Results of analysis of differentially expressed genes in insomnia disorder from GEO datasets

2.2.3 藥物-疾病靶點(diǎn)交集 利用微生信平臺將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，共獲得142 個藥物與疾病直接相關(guān)的交集靶點(diǎn)，如圖5 所示。

圖5 核心組方藥物-疾病交集靶點(diǎn)Fig.5 Core prescription drugs-disease intersection targets

2.2.4 疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建疾病-核心組方-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖6。從該網(wǎng)絡(luò)篩選出節(jié)點(diǎn)度較大（degree≥20）的13 個關(guān)鍵有效成分，編號分別為A、C、HHP1、HHP8、FL4、FL6、XF1、BZ1、HHP12、HHP10、HHP9、XF5、HHP6。在String 中導(dǎo)入142 個交集靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，使用MCODE 插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，得出3 個聚類網(wǎng)絡(luò)，如圖7 所示。選取每個聚類網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度最大的前1/8 的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為聚類1：蛋白激酶Bα（protein kinase Bα，AKT1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、原癌基因c-Fos（proto-oncogene c-Fos，F(xiàn)OS）、tumor necrosis factor（腫瘤壞死因子，TNF）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）；聚類 2：5-羥色胺受體 1A（5- hydroxytryptamine receptor 1A，HTR1A）；聚類3：多巴胺受體D2（dopamine receptor D2，DRD2）。

圖6 疾病-核心組方-有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Disease-drug-active ingredient-target network

圖7 交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)聚類圖Fig.7 Cluster PPI network of intersection targets

2.2.5 GO 和KEGG 富集分析結(jié)果 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入BinGO，并設(shè)置置信水平為0.01，進(jìn)行GO 富集分析，如圖8 所示，可得GO 生物過程主要包括：生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、代謝過程、信號過程、對刺激的應(yīng)答等；GO 分子功能則包括：結(jié)合、催化活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等；而GO 細(xì)胞成分以突觸、胞外區(qū)、細(xì)胞外域等為主。再將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入ClueGO，設(shè)定P≤0.01，最小聚類為4，K-score 為0.5 進(jìn)行KEGG 通路富集分析，如圖9 所示，根據(jù)P值選取其中主要通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸、雌激素信號通路、TNF信號通路等。

圖8 交集靶點(diǎn)GO 富集分析主要結(jié)果關(guān)聯(lián)圖Fig.8 Main results of GO enrichment analysis of intersection targets

圖9 交集靶點(diǎn)KEGG 關(guān)鍵通路圖Fig.9 Key pathways for KEGG enrichment analysis of intersection targets

2.2.6 分子對接結(jié)果 關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵成分分子對接結(jié)果大多結(jié)合能≤?20.90 kJ/mol，提示關(guān)鍵成分 與關(guān)鍵靶點(diǎn)大多可能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，具體見表4，而取其中對接最好的組合如圖10 所示，可見其對接方式主要為疏水口袋及氫鍵。

表4 關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對接結(jié)果Table 4 Results of molecular docking between key ingredients and key targets

圖10 關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對接構(gòu)象Fig.10 3D image of molecular docking between key ingredients and key targets

3 臨床研究

3.1 材料

3.1.1 臨床資料 收集2020年6月至2021年3月山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院治未病中心門診符合納入標(biāo)準(zhǔn)的失眠癥女性患者，所有患者均簽署知情同意書，并通過山西中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查（編號為2021LL052）。

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：符合失眠癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括《中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》（CCMD-3）[8]中的癥狀標(biāo)準(zhǔn)、嚴(yán)重標(biāo)準(zhǔn)、病程標(biāo)準(zhǔn)等；女性患者，年齡在20～65 歲；患者知情，并同意接受本臨床治療者。

（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：未按規(guī)定，無法判斷或數(shù)據(jù)不全等，影響療效和安全性判斷者；妊娠、哺乳期婦女，使用雌激素藥物或?qū)Ρ舅幬镞^敏者；嚴(yán)重軀體疾病、實(shí)質(zhì)性臟器損害、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及其他精神 疾病者；酗酒或藥物依賴者。

3.1.2 藥品與試劑 核心組方（茯苓15 g、白術(shù)12 g、合歡皮12 g、柴胡12 g、香附10 g、白芍15 g、龍骨30 g、當(dāng)歸12 g、牡丹皮12 g、梔子10 g、白茅根15 g）配方顆粒劑（批號分別為20101171、20100681、20101301、20122271、20090341、20111331、21030641、21041211、20110481、20090701、20071201），江陰天江藥業(yè)有限公司；舒眠膠囊（0.4 g×36 粒，批號20200502）購于貴州大隆藥業(yè)有限責(zé)任公司；人血清 褪 黑 素（ melatonin， MT ）、 γ- 氨 基 丁 酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、多巴胺（dopamine，DA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（貨號分別為CEA908Ge、CEA900Ge、CEA851Ge、CEA808Ge），武漢云克隆科技股份有限公司。

3.1.3 主要儀器 DRAGONLAB MX-S 可調(diào)式混勻儀，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；LDZ5-2型離心機(jī)，北京離心機(jī)廠；THZ-92B 氣浴恒溫振蕩器，上海博迅有限公司設(shè)備廠；VERSA max-BNRO5709酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。

3.2 研究方法

3.2.1 分組及治療方法 共納入患者42 例，隨機(jī)分為對照組和治療組各21 例。治療組服用核心組方，1 劑/d，分2 次于早餐前半小時、睡前1 h 空腹200 mL 水沖服。對照組口服舒眠膠囊，3 粒/次，晚飯后、臨睡前各服用1 次。觀察期間，2 組病例均不得加服其他抗焦慮藥及安眠藥物，療程為4 周。

3.2.2 療效及安全性評價 統(tǒng)計治療前后對照組和治療組匹茲堡睡眠量表指數(shù)（PSQI）[11]及SPIEGEL 量表[12]評分變化，比較分析臨床效果。前者根據(jù)睡眠質(zhì)量、入睡時間、睡眠時間、睡眠效率、睡眠障礙、催眠藥物、日間功能障礙7 項指標(biāo)評分，后者則包括入睡時間、睡眠總時間、夜醒次數(shù)、睡眠質(zhì)量、夢擾多少、醒后感覺6 項指標(biāo)；前者總分21 分，其中6～10 分為睡眠基本正常，后者總分42 分，以小于12 分為睡眠基本正常，兩者均為得分越高，睡眠質(zhì)量越差。統(tǒng)計治療前后兩組患者心電圖、肝腎功能、血尿常規(guī)情況以判斷藥物基本安全性。

3.2.3 血清MT、GABA、DA、5-HT 水平 治療前后分別空腹抽取患者靜脈血，離心（5400 r/min、10 min）獲得血清，將血清分裝后，?20 ℃避光保存，檢測時解凍后用ELISA 試劑盒檢測其血清中的MT、GABA、DA、5-HT 水平，并統(tǒng)計兩組治療前后的變化情況。

3.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用±s描述，若符合正態(tài)性、方差齊性采用成組t檢驗(yàn)，自身前后比較用配對t檢驗(yàn)；不符合方差齊性時用t′檢驗(yàn)；未滿足要求者自身前后比較用配對秩和檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布選擇秩和檢驗(yàn)；計數(shù)資料則使用χ2檢驗(yàn)，確定P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)差異。

3.3 臨床研究結(jié)果

3.3.1 患者一般資料比較 納入失眠癥女性患者42 例，其中對照組年齡28～65（51.33±9.83）歲，失眠病程1～9（4.24±2.57）個月；治療組年齡32～64（51.90±9.91）歲，失眠病程2～9（4.48±2.34）個月，兩組患者之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.3.2 兩組療效及安全性比較 兩組患者在治療前PSQI 評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），治療后PSQI評分均降低，與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中治療組下降更明顯；SPIEGEL 量表評分得到相同結(jié)果，見表5；兩組患者治療前后肝腎功能、心電圖、血尿常規(guī)變化均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表6。未見與服用2 種藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。

表5 兩組治療前后量表總體評分比較 ( ± s, n = 21 )Table 5 Comparison on total scores before and after treatment between two groups ( ± s, n = 21 )

表5 兩組治療前后量表總體評分比較 ( ± s, n = 21 )Table 5 Comparison on total scores before and after treatment between two groups ( ± s, n = 21 )

與同組治療前比較：*P＜0.05；與對照組治療后比較：#P＜0.05；與對照組比較：△P＜0.05，表7 同*P ＜ 0.05 vs same group before treatment; #P ＜ 0.05 vs control group after treatmennt; △P ＜ 0.05 vs control group, same as fig.7

PSQI SPIEGEL 組別 治療前 治療后 治療前后差值 治療前 治療后 治療前后差值 對照 15.05±4.25 10.90±4.27* 4.14±2.76 19.14±7.26 12.38±4.57* 6.76±4.39 治療 15.90±3.14 9.62±4.36* 6.29±5.64△ 19.95±7.07 9.71±4.85*# 10.24±5.94△

表6 兩組患者治療前后安全性相關(guān)指標(biāo)比較Table 6 Comparison on safety factor before and after treatment between two groups

3.3.3 兩組治療前后血清MT、GABA、DA、5-HT水平比較 兩組患者治療前4 項指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，治療組患者治療后MT 水平升高，5-HT 及DA 水平降低并差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），GABA 水平升高但無統(tǒng)計學(xué)意義；治療組與對照組相比，治療前后MT、5-HT、DA 水平的差值有統(tǒng)計學(xué)意義，見表7。

表7 兩組患者治療前后血清MT、GABA、DA、5-HT 水平比較 ( ± s, n = 21)Table 7 Comparison on the serum MT, GABA, DA and 5-HT levels before and after treatment between two groups ( ± s, n = 21)

表7 兩組患者治療前后血清MT、GABA、DA、5-HT 水平比較 ( ± s, n = 21)Table 7 Comparison on the serum MT, GABA, DA and 5-HT levels before and after treatment between two groups ( ± s, n = 21)

MT/(pg·mL?1) GABA/(pg·mL?1) DA/(ng·mL?1) 5-HT/(pg·mL?1) 組別 治療前 治療后 治療前后差值 治療前 治療后 治療前后差值 治療前 治療后 治療前后差值 治療前 治療后 治療前后差值對照 197.08±61.05 201.50±86.63 ?4.42±83.52 16.76±7.09 18.28±12.61 ?1.52±8.86 200.14±75.19 170.48±116.79 29.66±155.53 108.71±67.79 118.91±93.52 ?10.20±49.06 治療 197.46±52.26 266.37±65.81*# ?68.92±85.04△ 17.63±7.57 23.09±7.92* ?5.46±5.77 206.65±106.89 113.15±50.38*# 93.50±88.38△ 122.06±51.14 79.11±50.89*# 42.95±30.48△

4 討論

4.1 賈躍進(jìn)治療女性失眠思路

《靈樞·大惑論》[13]有：“衛(wèi)氣不得入于陰，長留于陽，留于陽則陽氣滿，……不得入于陰則陰氣虛，故目不瞑矣”之說。因此失眠的本質(zhì)就是營衛(wèi)、陰陽之氣運(yùn)行節(jié)律的紊亂，失眠的總病機(jī)為“營衛(wèi)失和、陰陽不交”[14]。同時營衛(wèi)、陰陽之氣是一身之氣的組成部分，受一身之氣的調(diào)控，故賈躍進(jìn)認(rèn)為治療失眠癥應(yīng)“調(diào)氣”為先，“調(diào)氣”的重點(diǎn)則是調(diào)氣機(jī)，具體到臟腑，應(yīng)責(zé)之與氣機(jī)相關(guān)性較大的肝、脾（胃）二樞機(jī)。女子以肝為先天，以血為本，脾胃亦為氣血生化之源，丹溪有言“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉”[15]，故女子較之男子更易出現(xiàn)“郁”，從而引發(fā)氣機(jī)不暢以及在此基礎(chǔ)上造成的氣血兩方面皆生成或代謝障礙，最終導(dǎo)致失眠。且其失眠往往病程較長，易出現(xiàn)“氣郁則生濕，濕郁則成熱，熱郁則成痰，痰郁則血不行，血郁則食不化”[15]的傳變。故臨床治療女性失眠，賈躍進(jìn)常注重疏肝行氣、調(diào)護(hù)脾胃及通降腑氣，多以逍遙散類方佐以香附、陳皮、川楝子、元胡、丹皮、梔子、知母、玫瑰花、合歡皮、黨參、麻子仁、炒萊菔子、半夏、杏仁等藥物，療效頗佳。

4.2 數(shù)據(jù)挖掘探究用藥規(guī)律

從數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果可得，治療藥物中使用頻率最高者為茯苓、白術(shù)、合歡皮、柴胡、香附、白芍、龍骨、當(dāng)歸、牡丹皮、梔子、白茅根?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為這些藥物具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗焦慮或神經(jīng)保護(hù)的作用，其中一些藥物兼具緩解女性更年期癥狀、保護(hù)肝臟、治療消化疾病的功效[16-26]。根據(jù)藥性分布規(guī)律分析，應(yīng)用最多者為平、溫、微寒、寒，可見從整體來看，賈師對于女性失眠癥的治療并無明顯寒熱偏向，因氣血運(yùn)行障礙寒熱均可見，即“氣有余便是火，氣不足便是寒”“血證有四：曰虛，曰瘀，曰熱，曰寒”；而藥味主要分布在甘、辛、苦，與藥性結(jié)果相一致，其中甘味藥有補(bǔ)益氣血、顧護(hù)脾胃、調(diào)和諸藥之功，辛、苦味藥辛開苦降，燮理樞機(jī)，令氣血自和；藥物的歸經(jīng)則主要?dú)w肝、脾、心、肺、腎、胃6 經(jīng)，其中中焦斡旋、龍虎回環(huán)、水火相濟(jì)都與周身氣機(jī)運(yùn)行密切相關(guān)，此處足見賈躍進(jìn)治療女性失眠的調(diào)氣為先、整體論治之思路。藥物關(guān)聯(lián)分析中篩選出的20 對核心關(guān)聯(lián)組合均是茯苓、白術(shù)、合歡皮、柴胡、香附、白芍、當(dāng)歸、牡丹皮、梔子、白茅根10 味藥物的組合，其中丹皮、梔子、當(dāng)歸、白芍、柴胡、茯苓、白術(shù)7 味是丹梔逍遙散的主要藥物，可以治療肝郁血虛脾弱或郁而化熱之候，為中醫(yī)婦科常用方；香附為“氣中之血藥”，在行氣解郁的同時兼顧血分；合歡皮解郁安神、白茅根涼血清熱兼降肺氣，諸藥充分體現(xiàn)了應(yīng)對女子失眠應(yīng)兼治氣血兩綱，顧護(hù)后天、佐以清熱的治療原則。聚類分析所得的4 個聚類處方中C1為賈躍進(jìn)治療女性失眠常用之佐使藥，意在通腑降氣；C2、C3 分別是二陳湯、四君子湯及其類方的主要成分，體現(xiàn)了女性失眠治療中以中焦樞紐為中心的調(diào)氣方法，即“一氣周流”；C4 則主要是關(guān)聯(lián)分析中所得的成分，故不贅述。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析中所獲的核心藥物組成與關(guān)聯(lián)分析中的10味藥物重合度極高，僅龍骨一味出入，綜合龍骨的用藥頻率，故取之為核心組方，該組方經(jīng)過賈躍進(jìn)分析，認(rèn)為可反映其臨床用藥，并曾在臨床上經(jīng)過一定的使用，安全有效。

4.3 網(wǎng)絡(luò)藥理分析作用機(jī)制

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得出核心組方治療女性失眠癥的13 個主要有效成分，其涉及除龍骨、牡丹皮外的所有藥物，可見其多藥物、多成分的作用機(jī)制，尤其是編號為A 和C 的成分，體現(xiàn)了方中藥物的共性，兩成分是存在于多種中藥材中的植物甾醇，前者在動物實(shí)驗(yàn)中被驗(yàn)證可上調(diào)谷胱甘肽、GABA 水平，下調(diào)DA、丙二醛、TNF-α、乙酰膽堿酯酶水平從而調(diào)節(jié)精神癥狀、改善腦功能[27]，后者則可通過抑制TNF-α 的炎癥反應(yīng)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[28]，亦有實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可增加小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的去甲腎上腺素、5-HT 等神經(jīng)遞質(zhì)的水平而表現(xiàn)抗抑郁活性[29]；編號FL4、FL6 的成分屬于茯苓中的三萜類化合物，研究顯示其具有一定鎮(zhèn)靜作用[30]；XF1 屬香附中的揮發(fā)油類，動物實(shí)驗(yàn)得出該類物質(zhì)能通過調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)及5-HT 水平而表現(xiàn)抗焦慮的作用[31]；XF5 是已知的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、助眠藥物；BZ1 為主要成分的混合物被研究證實(shí)具有治療抑郁癥的潛力[32]；HHP8 為合歡皮中的木脂素類成分，有研究報道稱該物質(zhì)可有安神活性[33]；HHP1為多種植物中存在的黃酮類，動物實(shí)驗(yàn)認(rèn)為其可增加非快速眼動睡眠[34]。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)所得的靶點(diǎn)聚類中，聚類1 主要包括IL-2、IL-6、TNF、VEGFA等參與免疫的細(xì)胞因子以及一些參與合成、代謝的激酶，而免疫與睡眠是雙向關(guān)聯(lián)的[35]；聚類2、3則主要包括5-HT、DA 等神經(jīng)遞質(zhì)，而睡眠-喚醒過程被認(rèn)為是由神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的。

目前失眠癥的病理機(jī)制并不明確，但較公認(rèn)的有神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)障礙（GABA、5-HT、DA、去甲腎上腺素等）、信號傳導(dǎo)障礙（下丘腦-垂體-腎上腺軸、HPA 軸）、代謝障礙（能量、脂質(zhì)、氨基酸及腸道微環(huán)境等）、內(nèi)分泌失調(diào)（生長激素、食欲素、性激素等）、免疫功能異常（炎癥）、遺傳（基因）及心理因素刺激等引起睡眠-喚醒節(jié)律紊亂[36-38]，而就女性失眠癥而言，女性一生的睡眠狀況受到雌、孕激素的調(diào)節(jié)[39]，而其中雌激素是神經(jīng)系統(tǒng)的有效調(diào)節(jié)劑，可通過直接與雌激素受體結(jié)合或調(diào)節(jié)GABA 能、DA 能、5-HT 能突觸傳遞而調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而這幾方面都是參與調(diào)節(jié)睡眠-覺醒的主要機(jī)制[40-44]。由GO 富集分析得到的主要生物結(jié)果對以上女性失眠的機(jī)制幾乎都有涉及，可見核心組方參與多種機(jī)制，可從多個途徑對女性失眠癥發(fā)揮治療作用。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，神經(jīng)活性配體- 受體相互作用、血清素能突觸、多巴胺能突觸為最主要的通路，另外還有雌激素信號通路及TNF 信號通路亦涉及女性失眠癥的有關(guān)機(jī)制。由分子對接結(jié)果可發(fā)現(xiàn)核心組方的關(guān)鍵分子與關(guān)鍵靶點(diǎn)大多可形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其中對接分?jǐn)?shù)較高的靶點(diǎn)為AKT1、HTR1A、DRD2。綜上，核心組方可得主要在于其多成分通過神經(jīng)遞質(zhì)方面的途徑，涉及神經(jīng)遞質(zhì)方面的靶點(diǎn)發(fā)揮其治療作用，而神經(jīng)遞質(zhì)主要涉及5-HT、DA，故選兩者及當(dāng)下治療失眠藥物的主要作用靶點(diǎn)GABA 和治療圍絕經(jīng)期失眠藥物的主要作用靶點(diǎn)MT[45]作為研究指標(biāo)。

4.4 臨床對照研究驗(yàn)證假設(shè)

本研究采用的對照組舒眠膠囊為臨床應(yīng)用廣泛且較多研究認(rèn)為安全、有效的藥物，可以治療以肝郁氣滯為主的多種證型的失眠癥，而賈躍進(jìn)經(jīng)多年臨床實(shí)踐認(rèn)為女性失眠多以肝郁氣滯及其相關(guān)證型為主，因此選擇該藥為療效的陽性對照藥物，而相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)則證實(shí)其可通過調(diào)節(jié)GABA、5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)而實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)靜催眠作用[46]，故其亦可作為作用機(jī)制的陽性對照藥物。雖其與核心組方存在藥物的交集（柴胡、白芍、合歡皮），但其無論是劑型、用量和其他成分都存在差異性，另外通過數(shù)據(jù)挖掘與分子對接的分析可以看出，核心組方發(fā)揮作用的主要藥物可能集中在白術(shù)、茯苓等藥物，故兩者差異性較之相似性更甚，存在比較的意義。通過臨床研究得出，兩組患者臨床量表分析皆顯示其癥狀緩解，說明了兩者的有效性，兩者相比則核心組方的2 項量表評分下降更為明顯，故更加有效，而這種療效的差異性可能在于核心組方來源于賈躍進(jìn)臨床治療女性失眠的有效驗(yàn)方，故相比于舒眠膠囊，在應(yīng)對女性失眠癥中存在一定的特異性，且與核心組方組成相似的方劑丹梔逍遙散，多用于臨床治療女性包括失眠癥的多種疾病[47-50]；而服藥前后體檢指標(biāo)則說明兩者皆具安全性；相比對照組，服用核心組方后的患者血清MT 水平明顯升高，5-HT 及DA 水平明顯下降，且治療前后3 者水平差值相較對照組亦具有統(tǒng)計學(xué)意義，但血清GABA 水平兩組皆無統(tǒng)計學(xué)意義的變化，但其治療前后GABA 水平差值兩組相比則有統(tǒng)計學(xué)意義。鑒于目前公認(rèn)5-HT 和DA 的作用是促進(jìn)清醒和抑制慢波睡眠或快速眼動睡眠[51]，MT、GABA 的作用則相反[52-53]，因此可一定程度認(rèn)為核心組方可通過升高M(jìn)T 水平，降低5-HT、DA 水平而起到治療女性失眠的作用，而對GABA 的調(diào)節(jié)則證據(jù)不顯著，此結(jié)果對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)論也實(shí)現(xiàn)了驗(yàn)證，證明其有一定的指導(dǎo)作用。但是目前關(guān)于失眠神經(jīng)遞質(zhì)的研究亦有指向5-HT含量增高有益于睡眠，與本研究結(jié)論有一定出入，而相關(guān)研究也確認(rèn)在某些情況下（多為兼有抑郁），5-HT 會促進(jìn)睡眠[54]，故其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，筆者認(rèn)為該差異可能與本研究探討的女性病例大多屬于失眠的肝郁化熱型而處于機(jī)體代謝較旺盛而非抑郁狀態(tài)有關(guān)，另外網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所得的涉及雌激素及免疫的結(jié)論仍有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

綜上所述，賈躍進(jìn)老中醫(yī)治療女性失眠癥的用藥思路是以調(diào)理樞機(jī)為主，兼顧氣血兩綱，重在調(diào)和肝脾；而據(jù)其用藥規(guī)律則可得治療女性失眠癥的核心組方為茯苓、白術(shù)、合歡皮、柴胡、香附、白芍、龍骨、當(dāng)歸、牡丹皮、梔子、白茅根；根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和臨床研究得出該核心組方主要通過升高M(jìn)T，降低5-HT、DA 2 類神經(jīng)遞質(zhì)而發(fā)揮對女性失眠癥的治療作用。該結(jié)論可為女性失眠癥的進(jìn)一步研究及臨床用藥提供指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突