升降散治療COVID-19的網絡藥理學機制

趙院院，曹利華，李秀敏，苗明三

（1.河南中醫藥大學 藥學院，鄭州 450046；2.紐約醫學院 微生物和免疫學科，紐約 10595）

升降散源于《傷寒溫疫條辨》，是治療瘟疫十五方之首方，該方由白僵蠶、蟬蛻、姜黃和大黃4種藥物組成。其“一升一降，內外通和，而雜氣之流毒頓消矣！”國醫大師李士懋認為，凡存在氣機壅塞不通時，均可用升降散來調理氣機，透邪外出［1］。蔣建勝［2］通過臨床實踐發現升降散對小兒病毒性肺炎具有良好的治療作用，可以明顯改善小兒咳嗽、發熱等癥狀。有研究證實升降散可抗流感病毒和提高機體的免疫力，通過實驗研究發現可明顯減輕小鼠的肺部病變程度，通過臨床對比西藥發現，升降散降溫效果平穩顯著［3］。

新型冠狀病毒（COVID-19）［4］是一種呈圓形或橢圓形，其直徑在60～140 nm的β屬的冠狀病毒，傳染性強，可通過多種途徑傳播，免疫力低下和有基礎病的人群更易感染，患者的癥狀主要表現為發熱、胸悶氣短、干咳、渾身乏力酸痛等癥狀，重癥患者表現出急性呼吸窘迫癥狀、休克、凝血功能障礙甚至導致死亡［5］。中醫藥在“非典”時期就發揮了獨特的作用，在本次抗擊疫情中也發揮了獨特的療效。唐璇等［6］通過檢索、分析新冠肺炎疫情爆發以來使用COVID-19診療方案或中醫藥防治方案的文件后發現，升降散作為經典名方位居前列。但是升降散是如何發揮治療COVID-19的作用，目前尚不清楚。因此，基于網絡藥理學分析研究升降散是如何發揮對COVID-19的潛在療效，探討其作用機制，可為治療COVID-19提供參考。

1 材料

中藥成分和靶點預測數據庫：中藥系統藥理學技術平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）；中藥分子機制的生物信息學分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional chinese medicine，BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）。疾病有關靶點數據庫（gene cards，GC https://www.genecards.org/）。蛋白互作數據庫：檢索相互作用基因的搜索工具（search tool for the retrieval of interacting genes，STRING，https://string-db.org/）。生信在線分析平臺：DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）。網絡分析及作圖軟件：Cytoscape 3.7.2；Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），R語言軟件包。

2 方法

1）升降散活性成分及對應靶點的篩選

以升降散的組方中藥“大黃”“姜黃”“僵蠶”“蟬蛻”為檢索詞，以藥代動力學有關參數為設定依據，口服生物利用度值設為（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性設為（drug-likeness，DL）≥0.18從TCMSP［7］篩選升降散的活性成分及相關靶點；同時借助BATMAN-TCM數據庫［8］，將條件設置為得分（score）大于20，P值小于0.05，得到升降散活性成分及相關靶點。合并以上數據庫得到活性成分及對應靶點。最后通過Unipro和NCBI Gene數據庫將靶蛋白轉換為官方名稱并進一步校正。

2）COVID-19靶點的預測

以“novel coronavirus pneumonia”為檢索詞，限定條件為“Homo sapiens”，通過Gene Cards數據庫獲取COVID-19相關靶點。

3）升降散治療COVID-19的潛在靶點

借助Venny2.1.0在線繪圖軟件，將升降散中活性成分的有關靶點和有關COVID-19的靶點進行交集，得到升降散治療COVID-19的潛在靶點。

4）成分－靶點網絡圖的構建

將包含活性成分、活性成分作用COVID-19的潛在靶點、相互作用關系屬性的文件，導入Cytoscape3.7.2軟件，構建“升降散－活性成分-COVID-19靶點”網絡圖。

5）蛋白－蛋白相互作用（PPI）網絡的構建及關鍵靶點的篩選

將升降散潛在治療COVID-19的靶點導到STRING數據庫［9］，把物種設定為“Homo sapiens”，交互作用評分大于0.7并隱藏無相互作用的靶點，下載.tsv格式的PPI文件。將該文件導入到Cytoscape3.7.2軟件中，通過Neywork Analyze進行拓撲分析，并按照“Degree”值大小篩選關鍵靶點。

6）GO富集分析與KEGG通路分析

通過DAVID網站［10］對關鍵靶點蛋白進行Go富集和KEGG通路分析并進行篩選，得到顯著富集（P＜0.01）的通路，并用R語言進行KEGG通路富集分析，預測升降散對COVID-19的潛在作用。

3 結果

3.1 升降散中活性化合物及對應靶點

本研究將OB≥30%、DL≥0.18作為活性成分篩選條件，篩選出活性化合物32種，通過TCMSP數據庫收集升降散活性成分預測靶點70個，BATMAN-TCM數據庫收集靶點382個，合并2個數據庫所得靶點，去除重復靶點，共得靶點437個。其活性化合物和相關靶點數見表1。

表1 升降散中活性化合物和相關靶點數

續表（表1）

3.2 升降散治療COVID-19的潛在靶點

通過Gene Cards數據庫獲得有關COVID-19的靶點共計259個；將升降散活性成分與COVID-19對應靶點輸入到Venny2.0.1在線繪圖工具中，得到升降散治療COVID-19的潛在作用靶點，如圖1所示，升降散作用COVID-19的潛在靶點有30個，占所有靶點的4.5%。

圖1 升降散活性成分靶點-COVID-19靶點韋恩圖

3.3 活性成分-靶點網絡圖

利用Cytoscape3.7.2軟件把化合物、疾病以及化合物與疾病的交互靶點做“成分－靶點”圖，如圖2所示。節點越大代表Degree值越大，化合物Degree值排名前5的為蘆薈大黃素（aloe-emodin）、β-谷甾醇（beta-sitoseterol）、草酸銨（Ammonium Oxalate）、麥角胺（Ergotamine）和（＋）-表兒茶素（（-）-catechin）。

圖2 升降散-活性成分-COVID-19-靶點示意圖

3.4 PPI網絡圖的建立和核心靶點的選取

將升降散與COVID-19的交互靶蛋白導到STRING數據庫，得到PPI網絡文件（.tsv格式），將該文件導入Cytoscape3.7.2中，保留“node1”“node2”“combination score”的數據，選擇工具中的Network Analyzer對網絡進行拓撲分析，得到PPI網絡圖，如圖3（a）所示。該圖由節點和邊組成，其中節點越大、顏色越深，代表“Degree值”越高，則該節點連接的節點就越多，可能是治療COVID-19的關鍵靶點，因此選取“Degree值”排名前15的靶點定義為關鍵靶點，即TNF、IL1B、TP53、PTGS2、FOS、NFKB1、CCL2、IL10、CASP8、TGFB1、IL13、PPARG、CASP3、BAX和NOS2，關鍵靶點的PPI網絡如圖3（b）所示，節點數為15，邊有56條，平均節點度數為7.67，平均局部聚類系數為0.717。

圖3 潛在靶點PPI網絡示意圖（圖中節點越大顏色越深代表“Degree值”越大）

3.5 GO富集與KEGG通路分析

把關鍵靶點導到DAVID數據庫進行富集分析，得到GO分析條目中有154種生物學過程（BP）、12種細胞組成（CC）和21種分子功能（MF），GO功能富集分析各條目功能所占百分比見圖4。

圖4 GO功能富集分析各條目功能所占百分比示意圖

選取排名前10且P＜0.01的功能進行可視化分析，如圖5所示，BP占GO功能富集條目的82%，包括炎癥反應、細胞對有機環狀化合物的反應、細胞對機械刺激的反應、轉錄的正調控，DNA模板、參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性的激活、脂多糖對細胞的作用、脂多糖參與的信號通路、對抗生素的反應、蛋白激酶B信號傳導和對藥物的反應的等；CC占7%，包括胞質溶膠、細胞外空間、死亡誘導信號復合體、細胞外區域以及細胞質；MF占11%，包括細胞因子活性、轉錄調控區DNA的結合、同種的蛋白質結合、蛋白質的異二聚活性、轉錄因子結合、酶結合、蛋白質均二聚活性、蛋白酶結合、染色質結合和蛋白質結合。KEGG通路分析中得到51條信號通路，選取P＜0.01且排名前20的進行分析，通路基本信息如表2所示，運用R語言作通路氣泡圖（圖6），通路名稱展示在Y軸，其所占百分比在X軸展示，通路的富集基因數由氣泡面積展現，P值的大小由氣泡顏色的深淺呈現。

圖6 升降散關鍵靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

表2 KEGG排名前20的通路基本信息（P＜0.01）

圖5 GO功能分析中各條目功能中排名前10且P＜0.01的直方圖

4 討論

運用網絡藥理學對升降散治療COVID-19潛在作用靶點進行分析，通過構建“成分－靶點”網絡圖，根據網絡拓撲參數分析得到15個關鍵靶點，分別為TNF、IL1B、TP53、PTGS2、FOS、NFKB1、

CCL2、IL10、CASP8、TGFB1、IL13、PPARG、CASP3、BAX、NOS2。這些靶點主要來自升降散中成分排名靠前的蘆薈大黃素、β-谷甾醇、草酸銨、麥角胺和（＋）-表兒茶素等化合物。據報道［11］，蘆薈大黃素具有抗炎、抗菌和抗病毒的藥理活性。Li等［12］研究發現蘆薈大黃素能夠降低病毒誘導的細胞病變并抑制甲型流感病毒復制，蘆薈大黃素可能對病毒有一定的抑制作用。β-谷甾醇是動植物細胞膜的主要組成成分，動物實驗發現其可通過抑制TNF-α和IL6的釋放和下調NF-kB通路中的蛋白表達，對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷具有保護作用［13］。草酸銨是僵蠶中的主要活性成分，具有良好的抗凝血［14］，祛痰定驚等作用［15］。麥角胺是天然麥角堿生物堿的代表，對5-HT1A，5-HT1B／1D，α（2）-腎上腺素能受體和D-2-樣受體具有親和力，具有一定的鎮痛和抗炎作用［16］。（＋）-表兒茶素是一種天然多酚類化合物，具有較強的抗氧化和抗炎作用，并可干擾四氯化碳誘導肝纖維化的進程［17］。升降散中的主要成分（蘆薈大黃素、β-谷甾醇、草酸銨、麥角胺和（＋）-表兒茶素）多具有抗炎、抗菌、抗病毒和保護肺部的作用，進一步支持升降散對COVID-19有潛在的療效。

GO功能富集分析中生物進程主要是對炎癥、機械刺激、抗生素、有機環狀化合物的反應，以及對轉錄、凋亡、增殖的調控。生物過程涉及炎癥相關靶點有FOS、TNF、CCL2、PTGS2、IL1B，IL13、NFKB1、TGFB1、IL10。脂多糖對細胞的作用涉及的靶點有TNF、CCL2、NFKB1、NOS2、IL10。脂多糖參與的信號通路涉及的靶點有TNF、CCL2、IL1B、TGFB1。KEGG通路分析中排名前20的通路中有10條通路為病毒和細菌感染相關通路，包括查加斯病（美國錐蟲病）、結核、利什曼病、乙型肝炎、單純皰疹感染、百日咳、阿米巴病、弓形蟲病、瘧疾和軍團菌病；炎癥相關通路有TNF信號通路、MAPK信號通路、類風濕關節炎和炎性腸病（IBD）等；免疫相關通路有NOD樣受體信號通路等。

有研究對臨床上的COVID-19患者進行臨床檢查［18］，發現其體內的TNF-α、IL10、IL1B等炎癥因子表達水平異常。李貝金等［19］對新冠肺炎病毒感染人體的文獻進行分析，認為炎癥與該病的嚴重程度密切相關，炎癥因子的增多，會加速組織的損傷。有對升降散治療重癥炎癥患者的研究［20］表明，升降散可以顯著降低患者體內的TNF-α、內毒素水平。南淑玲等［21］通過研究升降散對小鼠肺炎模型發現，升降散可降低小鼠體內的IL1B和升高抗炎因子IL10的水平而起到治療肺炎的效果。CCL2是一種趨化因子，具有特異性趨化和活化炎癥因子的作用并可誘導炎癥因子聚集到氣道上皮，誘發氣道炎癥，損傷肺部［22］。NFkB1是一組具有多功能作用的核蛋白因子，可參與炎癥反應，免疫反應以及增殖和凋亡等相關基因的轉錄調控［23］。NF-κB的激活過程包括涉及TNF-α的細胞外正反饋途徑和涉及抑制蛋白的細胞內負反饋途徑，且越來越多的研究表明，TNF-α可以通過激活NFKB信號通路調節炎癥、氧化應激、凋亡和自噬相關分子的表達，從而影響各種細胞的活性。NFkB1作為NFkB家族重要成員之一，有研究表明升降散可通過抑制肺微血管內皮細胞NFKB1的表達，抑制炎癥反應，對肺的急性損傷具有保護作用［24］。TGFB1是一種轉化生長因子，可促進肌成纖維細胞增殖與活化，使細胞外基質沉積并抑制其降解，促進肺纖維化的發生［25］。TNF信號通路、MAPK信號通路作為經典的炎癥通路，被激活后，對肺部可造成一定的損傷［26］。NOD樣受體信號通路［27］是機體先天免疫應答的一部分，可介導促炎因子的釋放、介導免疫應答和病毒的入侵。通過對升降散中活性成分與抗病毒相關靶點的分析，發現其具有潛在的抗病毒作用。由此推測，升降散可能主要通過炎癥相關通路的FOS、CASP3、

TNF、CCL2、PTGS2、CASP8、IL1B、NFKB1、TP53、TGFB1靶點；免疫相關通路的TNF、CCL2、CASP8、IL1B、NFKB1靶點發揮治療COVID-19的作用。通過以上分析，升降散可能作用多個靶點，尤其是炎癥因子靶點，發揮抗炎和保護肺部等的作用。

5 結論

升降散中蘆薈大黃素、β-谷甾醇、草酸銨、麥角胺和（＋）-表兒茶素可能是治療COVID-19的有效成分，其作用機制可能是作用多個靶點，尤其是炎癥因子，干擾病毒和細菌感染相關通路，發揮抗炎、抗病毒的作用。因此，升降散通過多靶點、多通路起到抗病毒、抗炎的作用，從而對COVID-19達到治療的效果。