HPLC法同時測定清火抗毒丸中三種成分的含量

郭慧青 趙穎 高振東 張旭東 顧艷麗 徐佳璐 謝宇鑫

【摘 要】 目的：創建HPLC 法同時測定清火抗毒丸中龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量。方法：色譜柱選擇ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液進行梯度洗脫，流速選擇1 mL·min-1，柱溫為30 ℃，波長選擇254 nm。結果：龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷分別在8.6～86 μg·mL-1（r=0.9999）、4.4～44 μg·mL-1（r=1）、5.5～55 μg·mL-1 （r=0.9998）范圍內的線性關系良好。龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的平均加樣回收率依次為101.24%（RSD=1.06%），98.64%（ RSD=1.04%），99.38%（ RSD=0.45%）。結論：該方法不僅簡單易行而且重復性好，其構建的標準有助于清火抗毒丸的質量控制。

【關鍵詞】 清火抗毒丸;龍膽苦苷;梔子苷;黃芩苷;含量測定

【中圖分類號】R284.2 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2021）11-0033-04

Abstract：Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of gentiopicroside， geniposide and baicalin in Qinghuo Kangdu Pills. Methods The analytical column was ODS-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， methanol-0.1% H3PO4 was mobile phase;gradient; the flow rate was 1 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was 254 nm. Results The linear range was 8.6-86 μg·mL-1（r=0.9999） for gentiopicroside， 4.4～44 μg·mL-1（r=1）for geniposide and 5.5～55 μg·mL-1（r=0.9998） for baicalin. The average recovery of gentiopicroside， geniposide and baicalin was 101.24%（RSD=1.06%），98.64%（ RSD=1.04%） and 99.38%（ RSD=0.45%） . Conclusion The method is simple， and repeatable， which can be used to determine the contents of three key constituents in Qinghuo Kangdu Pill at the same time， and it is a good method to control the quality of Qinghuo Kangdu Pill.

Keywords：Qinghuo Kangdu Pill; Gentiopicroside; Geniposide; Scutellaria Baicalensis; Content Determinat

清火抗毒丸是巴彥淖爾市眼科醫院中醫醫師常用且效果良好的內服組方，由梔子、龍膽、黃芩、黃連和黃柏等十三味藥組成，具有抗菌、抗炎、解毒、清熱等功效，適用于角膜炎、細菌性或病毒性結膜炎、瞼板腺感染及化膿性淚腺炎等眼瞼及眼眶炎癥疾病的治療。方中龍膽能夠殺毒抑菌、瀉肝膽實火，可以治療肝火過盛引起的目赤目腫目痛。其主要成分為龍膽苦苷，龍膽苦苷主要通過抑制多種炎癥介質的釋放起到抗炎鎮痛的作用[1]。梔子能用于清熱瀉火、涼血消腫解毒，可廣泛應用于治療因血熱導致的急性鼻出血、眼腫痛。梔子苷是梔子的主要成分，梔子苷抗炎、鎮靜、降壓、解熱作用突出[2]。黃芩主要有效成分為黃芩苷，黃芩苷有明顯抗菌作用[3]，機制有二：一是能有效的抑制細菌新的生物膜合成，致其繁殖減慢;二是使細菌生物膜的滲透性增加利于抗菌藥物進入。黃芩苷、龍膽苦苷和梔子苷三種成分共同具有抗炎解毒作用，為本方治療眼部炎癥及感染的主要有效成分，含量測定選擇同時測定這三種成分，不僅操作簡單、結果準確可靠，最重要的是能為本藥藥效是否良好提供標準，保證藥品質量。本實驗使用的高效液相色譜法具備操作自動簡便、檢測靈敏、分離效率高和分離速度快等優點，在生藥、復方中藥等復雜體系的成分分離分析中發揮重要作用。復方中藥中多指標的同時測定能直接反映藥品的質量的同時還能夠減少分析的成本，提升分析的準確度。該制劑目前已完成前期成型工藝，為提高藥品的質量控制要求，本實驗從主要成分的含量測定方面進行研究，擬制定清火抗毒丸的質量標準。

1 儀器與材料

1.1 儀器 真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、SB25-12DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），高效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000（賽默飛世爾科技有限公司），AR224CZ萬分之一電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.2 材料 黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-201706）;龍膽苦苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110770-201716）;梔子苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-201718）。清火抗毒丸（巴彥淖爾市殘聯眼科醫院提供，批號20190103、20190105、20190107），經內蒙古醫科大學中藥學渠弼教授鑒定。甲醇為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：ODS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液;柱溫：30℃;流速：1 mL·min-1;波長：254 nm。以下專屬性、線性關系、精密度、穩定性、重復性、加樣回收實驗均使用此色譜條件。梯度洗脫程序見表1。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、龍膽苦苷和梔子苷對照品適量溶于色譜甲醇，定容即得混標溶液，其每1 mL對照品溶液中包括黃芩苷、龍膽苦苷、梔子苷分別為55 μg、44 μg和86 μg。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定0.2 g清火抗毒丸粉末于錐形瓶中，加甲醇25 mL，精密稱定錐形瓶，密塞，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，重新稱定其重量，甲醇補足缺失重量，搖勻并濾過，取續濾液，續濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液[4]。

2.4 陰性對照溶液的制備 將本方各個藥材粉碎過篩，全方分別除去龍膽，梔子和黃芩按各自處方比混合，根據“2.3”項方法制備陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 取“2.2”、“2.3”、“2.4”項下溶液各10μL進樣，相同保留時間下，供試品溶液在龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷相應位置有色譜峰，陰性對照溶液相同位置未見干擾，表明該方法具有專屬性良好，結果如圖2所示。

2.6 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下溶液0.5、1、2、4、5 mL置5 mL容量瓶中，甲醇定容并搖勻，測定線性關系。以峰面積（Y）為縱坐標，對照品濃度（ X，mg·mL-1） 為橫坐標，作圖，分別得出龍膽苦苷的線性方程：Y=143.02X+0.0742（r=0.9999），梔子苷線性方程：Y=157.72X-0.0081（r=1），黃芩苷線性方程：Y=235.99X+0.4012 （r=0.9998）。龍膽苦苷在8.6～86 μg·mL-1、梔子苷在4.4～44 μg·mL-1、黃芩苷在 5.5～55 μg·mL-1與峰面積的線性關系良好。

2.7 精密度試驗 取“2.2”項下溶液，進樣6次，每次10 μL，記錄峰面積。龍膽苦苷、梔子苷以及黃芩苷對照品的峰面積RSD依次為0.16%、0.08%和0.13%（n=6），結果顯示該儀器精密度良好[5]。

2.8 穩定性試驗 取同批次樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在0、2、4、6、8、10、12、24 h分別進樣，記錄各峰面積，龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷峰面積的RSD依次為0.66%，1.97%，0.47%（n=6）。表明樣品溶液放置24 h各成分含量穩定。

2.9 重復性試驗 選同批次樣品（批號：20190103），按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，測定各峰面積，結果顯示龍膽苦苷、梔子苷以及黃芩苷峰面積的RSD 分別為1.0%、1.4%、1.5%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收試驗 取同批樣品6份（批號：20190103），精密稱定，每份約0.1 g，分別加入龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷對照品溶液1 mL（濃度依次為6.5、8、24.5 μg·mL-1），測定峰面積，各成分平均加樣回收率分別為101.24%、98.64%、99.38%，RSD分別為1.06%、1.04%、0.45%（n=6）。

2.11 樣品含量測定 取3個批次的樣品（批號：20190103、20190105、20190107），按照“2.3”項方法，制備供試品溶液平行樣3份，測定每批樣品中龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷的含量，結果見表2。

3 討論

3.1 選擇測定波長 紫外-可見分光光度儀測定結果顯示：龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的最大吸收波長分別是270 nm、242 nm、276 nm。改變波長進樣后，發現254 nm處同時測定含量時，各峰的分離度較好，基線較平，峰面積較大，所以選擇在254 nm下對三種成分進行含量測定[6-8]。

3.2 流動相的選擇 用甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液作為兩種待選流動相，當選用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫時，出峰時間較早，而且龍膽苦苷峰和梔子苷峰不能實現良好分離，并且基線不平穩;當采用甲醇-0.1%磷酸水溶液系統進行梯度洗脫時，此條件下各峰分離很好，而且均符合藥典的要求，因此選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相。

3.3 提取溶劑和方法 首先對50%甲醇、70%甲醇和甲醇三種提取溶劑進行考察，使用甲醇作提取溶劑時，提取出的供試品溶液中三種成分的綜合提取率最佳;采用不同時長超聲（15、30、60 min）處理時，發現超聲處理30 min和60 min的供試品溶液中三種成分的提取率無明顯差異，其中超聲15 min時的提取率較低，因此選擇超聲30 min提取，操作簡便且能量消耗少。

本實驗通過綜合考量測定波長、色譜條件、提取工藝等可能影響含量檢定的各類因素，篩選出適合同時測定三種成分的HPLC法，結果準確可靠，此法可作為清火抗毒丸的質量控制指標。

4 小結與展望

隨著現代檢測分析方法如高效液相色譜的不斷發展，復方中藥的研究也逐漸深入，分離、測定中藥有效成分，闡明中藥作用機理等工作正有序開展，并取得了可觀成果。復方中藥發揮藥效時通常是多種有效成分共同協作，可能是一味藥增強另一味藥的治療作用，或者是一味藥消除其他味藥的副作用，單獨測定一種主要有效成分通常不能很好控制復方藥的質量。因此在復方中藥的質量控制中多指標成分的分離與測定具有特別重要的意義。在同一方劑中，復方中藥的體內藥物動力學特征以及復方藥效受藥材中指標成分影響，而配伍藥材的比例與其各自含量又顯著影響指標成分的高低[9]。因此復方中藥配伍以后，各指標成分的比例、含量不僅僅能夠反映藥物制劑的工藝水平，更重要的是能夠表征和確保復方中藥（及其制劑）的藥物療效。清火抗毒丸是民間應用廣泛的復方中藥，其治療如上所述眼科疾病療效確切，但因其處方復雜，有效成分尚待分離確定，導致本藥生產過程中的質控環節難以規范。本實驗建立HPLC法同時測定清火抗毒丸龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的含量， 通過方法學驗證，本實驗所建立的方法不僅簡單，而且可靠，此法用于清火抗毒丸的質量控制將給制備和檢測工作帶來極大便利。清火抗毒丸仍有許多輔助發揮藥效的有效成分未被分離發掘，建立適當分析方法來測定其他重要組分，并詳細研究其作用靶點、機制通路都將是后續研究的方向。

參考文獻

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[4]郝福， 蔣曄， 李艷榮， 等. HPLC法測定龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷、黃芩苷和梔子苷[J]. 中草藥， 2006， 37（12）：1808-1809.

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[7]ZHU W J，FENG B，HAO C Y.Simultaneuos determination of three main component in Longdan Xiegan pills by HPLC-DAD[J]. Journal of Jilin Medical University（吉林醫藥學院學報）， 2016， 37（1）：4-6.

[8]FEI Y Q， NIE J.Quality Standard for Qingre Jiedu Tablets[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2013，19（9）：92-95.

（收稿日期：2020-11-03 編輯：程鵬飛）