HPLC法測定蒙成藥塔斯音-10中胡椒堿的含量

劉晶晶 李玉華

【摘 要】 目的：建立蒙成藥塔斯音-10中胡椒堿含量測定的方法。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法，色譜柱為InertSustain AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（77∶ 23），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長343 nm，柱溫30 ℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：胡椒堿在0.0103～0.2580 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，平均回收率為99.86%，RSD為0.76%。結(jié)論：該方法準確穩(wěn)定，重復(fù)性好，專屬性強，可用于蒙成藥塔斯音-10的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 塔斯音-10;高效液相色譜（HPLC）法;胡椒堿;含量測定

【中圖分類號】R284.1 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2021）11-0037-04

Abstract：Objective To establish the high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of Piperine in Mongolian Tasiyin-10.Methods The HPLC was carried out with InertSustain AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），using methanol-water （77∶ 23） as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was 343 nm and the column temperature was 30 ℃.Rseults The linear of Piperine was in the range of 0.0103～0.2580 μg （r=0.9993） . The average recovery was 99.86% （RSD=0.76%）.Conclusion This method is accurate，stable，reproducible and specific，which can be used for the quality control of Tasiyin-10.

Keywords：Tasiyin-10;HPLC;Piperine;Content Determination

塔斯音-10由蓽撥、雕糞炭、寒水石（煅）、萬年灰（制）、鐵線透骨草、全石榴、干姜、光明鹽、蘇格木勒、肉桂等10味藥組成[1]，主治胃火衰弱、胃寒食積、消化不良等[2]。蓽茇為胡椒科植物蓽茇Piper longum L. 的干燥近成熟果穗，作為中、蒙藥常用藥材，近些年來藥理研究發(fā)現(xiàn)蓽撥中所含胡椒堿Piperine具有抗氧化、抗炎殺菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗胃潰瘍、降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用[3-4]。作為臨床常用的蒙藥醫(yī)院制劑，目前為止，塔斯音-10質(zhì)量控制方面的標準嚴重缺失，只有簡單的外觀性狀和檢查項目[2]。建立塔斯音-10主要藥效成份胡椒堿含量測定的方法，能有效控制該成藥的內(nèi)在質(zhì)量，為該成藥質(zhì)量標準的提升提供參考。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀，Shimadzu LC-2030C液相色譜儀，InertSustain AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。92SM-202A型電子天平，XS3DU電子天平，KQ5200DE超聲波清洗機。

1.2 試藥 對照品胡椒堿（批號：110775—201706，98.9%）由中國食品藥品檢定研究院所提供;樣品塔斯音-10來源：1號樣品（批號：20190909）由通遼市蒙醫(yī)整骨醫(yī)院提供;2號樣品（批號：20181221）由庫倫旗蒙醫(yī)院制劑室提供;3號樣品（批號：20190223）由內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供。水為高純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 HPLC 方法學考察

2.1 色譜條件[5] 色譜柱：InertSustain AQ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Sepax Bio C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測波長343 nm。流動相：甲醇-水（77∶ 23），流速為1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取胡椒堿對照品10.32 mg，置100 mL棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL置10 mL棕色量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻即得胡椒堿對照品溶液（10.32 μg·mL-1）。

2.3 供試品溶液配制[6] 取本品粉末（過四號篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞棕色瓶中，精密加入無水乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 Hz）30 min，放冷，再稱定重量，用無水乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取按處方比例制備的不含胡椒堿藥材的陰性對照供試品，按2.3項下供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對照色譜圖中在與胡椒堿對照品以及供試品色譜圖相對應(yīng)的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性強，其他組分對胡椒堿的測定無干擾。色譜圖如圖1所示。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取胡椒堿對照品0.00645 g，置25 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為胡椒堿對照品儲備液（258 μg·mL-1）。精密吸取該貯備液40、200、400、600、800、1000 μL，分別置于10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋定容后得到含有1.032 μg·mL-1、5.16 μg·mL-1、10.32 μg·mL-1、15.48 μg·mL-1、20.64 μg·mL-1、25.8 μg·mL-1的胡椒堿對照品系列濃度溶液。精密量取上述各濃度的標準溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以對照品峰面積Y為縱坐標，相應(yīng)的對照的量X為橫坐標，進行線性回歸。得到胡椒堿回歸方程為：Y=71998X，r=0.9993，表明胡椒堿在0.0103～0.2580 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗 按2.3項下供試品溶液配制方法，精密稱取內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批號為20190223的樣品約0.1012 g，配制成精密度試驗溶液，精密吸取樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，重復(fù)進樣6次，測得峰面積的RSD值為0.36%，表明該方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密稱取內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批號為20190223的樣品約0.1012 g，按2.3項下供試品溶液制備方法配制穩(wěn)定性試驗溶液，室溫放置，分別在0、1、3、6、12、24 h進樣，記錄譜圖，測得峰面積。結(jié)果24 h內(nèi)峰面積的RSD值為0.59%，表明該方法提取的樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗 取內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批號為20190223的樣品6份，每份約0.1 g，精密稱定，按2.3項下供試品溶液制備方法配制重復(fù)性試驗溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算含量，結(jié)果6份平行樣的含量RSD值為1.48%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 準確度及范圍[7-8] 取已知含量的樣品（內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供的，批號為20190223）9份，每份約0.05 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，分別加入2.5項下胡椒堿對照品貯備液380 μL、650 μL、1105 μL，按2.3項下供試品溶液制備方法制成加標回收溶液，配制成高、中、低三個濃度的加樣回收溶液，精密量取上述9份樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1。三個濃度加標回收率平均值為99.86%，RSD值為0.76%。表明胡椒堿含量在1.9～5.7 μg·mL-1范圍內(nèi)測得的結(jié)果準確可靠。

2.10 不同色譜柱和儀器設(shè)備的耐用性試驗 換不同廠家、不同型號的色譜柱及不同的液相色譜儀，取內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供，批號為20190223的樣品，精密稱定，按2.3項下供試品溶液配制方法配制樣品溶液，精密吸取該樣品溶液和2.2項下的對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計算樣品中胡椒堿含量。結(jié)果見表2。

從表中數(shù)據(jù)可以看出，胡椒堿的含量變化不大（RSD值0.89%），表明該方法對不同色譜柱和儀器設(shè)備耐用性良好。3 樣品含量測定[9-10]

分別取三個廠家提供的塔斯音-10樣品粉末約0.1g，精密稱定，按2.3項下供試品溶液制備方法提取制備樣品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，測定結(jié)果見表3。

4 討論

成藥粉末以甲醇和無水乙醇作為提取溶劑進行超聲提取（功率120 W，頻率40 kHz），結(jié)果無水乙醇提取效率高于甲醇，故提取溶劑定為無水乙醇。為保證胡椒堿成分提取完全，實驗中考察了超聲提取15 min、30 min和60 min，結(jié)果胡椒堿的含量基本一致（RSD 0.31%），故提取時間定為30 min。

柱溫對胡椒堿與其它干擾組分的分離度影響較大。柱溫40 ℃時胡椒堿拖尾嚴重，與相鄰干擾組分峰分離度變小（R值為1.218，小于1.5），分不開。柱溫調(diào)整至30 ℃時，胡椒堿拖尾因子變小，與相鄰組分分離度變大，分離較好（R值為1.653）。故將柱溫設(shè)定為30 ℃。

本實驗通過專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗、不同色譜柱及儀器設(shè)備的耐用性考察，結(jié)果表明該方法準確可靠，可作為塔斯音-10中胡椒堿含量測定的方法。

參考文獻

[1]內(nèi)蒙古醫(yī)學院中醫(yī)系.蒙醫(yī)金匱蒙文版[G].呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版，1978：82.

[2]內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳.內(nèi)蒙古蒙成藥標準[M].呼和浩特：內(nèi)蒙古科學技術(shù)出版社，1984.

[3]喬佛曉，禹玉洪，李燕.蓽茇的藥理作用與毒性作用研究概述[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8（4）：507-512.

[4]李秦.蓽茇化學成分及藥理作用研究進展[J].中國傷殘醫(yī)學，2013，6（11）：457-458.

[5]國家藥典委員.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：235.

[6]薄彧坤，趙國君，楊 丹. 蓽撥中胡椒堿的提取方法研究[J].北方藥學， 2016，11（13）：120-121.

[7]張麗萍，韓 怡，施曉卉，等. HPLC 法同時測定蓽茇-大黃中 6 種成分的含量[J].實用藥物與臨床，2020，7（23）：628-631.

[8]徐 僮，杜歡，李琪，等. HPLC 法同時測定六味木香丸中4種成分[J].中成藥，2019，10（41）：2315-2318.

[9]潘 遐，才讓草，李 魁，等. HPLC 法測定藏藥石榴蓮花散中鞣花酸和胡椒堿的含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2019，19（28）：37-41.

[10]閆鳳杰，關(guān)金鳳. RP-HPLC法測定蘇格木勒-3湯中胡椒堿的含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2012（13）：35-36.

（收稿日期：2020-11-05 編輯：劉 斌）