黑果腺肋花楸花色苷通過Nrf2機制對Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

孟令帥，曹 森，彭 琳，馬立志，孟憲軍，周笑犁*

1貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴陽550005；2沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽110866

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又叫老年性癡呆，是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，能夠?qū)е掠洃泦适ВJ(rèn)知功能障礙，行為障礙，社會障礙，并且是癡呆的最常見原因[1,2]。據(jù)估計，全世界有2 400萬人患有癡呆癥，其中大多數(shù)人患有阿爾茨海默病[3]。此外，阿爾茨海默病是一種常見的與年齡相關(guān)的疾病，最常見于65歲或以上的人群[4,5]。因此，阿爾茨海默病仍然是人口老齡化的主要健康問題之一，阿爾茨海默病病例在未來幾十年注定會顯著增長。目前，有幾種假設(shè)可以解釋阿爾茨海默病的發(fā)病機制，包括β-淀粉樣蛋白(Aβ)肽和tau蛋白過度磷酸化，這些在阿爾茨海默病的發(fā)病機制中起主要作用[6]。此外，越來越多的證據(jù)表明氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在阿爾茨海默病中起關(guān)鍵作用[7]。相關(guān)研究表明，AD患者的氧化應(yīng)激能夠?qū)е录?xì)胞凋亡[8,9]。同時，氧化應(yīng)激能夠激活細(xì)胞保護(hù)機制，包括內(nèi)源性抗氧化劑和抗氧化酶系統(tǒng)。參與這種保護(hù)作用的主要抗氧化酶是血紅素氧合酶-1(HO-1)，超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄激活主要受核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(Nrf2)[10]的調(diào)節(jié)。一些植物化學(xué)物質(zhì)可以激活Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號，從而上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，增強神經(jīng)元對氧化應(yīng)激的抵抗力[11]。在靜息狀態(tài)下，Nrf2以復(fù)合物的形式存在。當(dāng)復(fù)合物被破壞時，Nrf2易位至細(xì)胞核并與ARE序列結(jié)合以促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)。已知Aβ的細(xì)胞外沉積會導(dǎo)致神經(jīng)元的氧化損傷和細(xì)胞凋亡，并且Aβ也被證明可誘導(dǎo)ROS和過氧化氫(H2O2)過量產(chǎn)生，并降低SOD和GSH-Px水平，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激[12]。

目前，花色苷對于阿爾茨海默病的預(yù)防、保護(hù)等作用已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展。Heo等[13]研究了草莓花色苷對阿爾茨海默病細(xì)胞模型的神經(jīng)保護(hù)活性。研究表明，草莓花色苷能夠減少氧化應(yīng)激的發(fā)生以及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞起到保護(hù)的作用。Badshah等[14]研究了黑大豆中花色苷對Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性細(xì)胞和動物模型的神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明了花色苷通過維持Ca2+穩(wěn)態(tài)，有效的減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞能夠起到保護(hù)作用。Meng等[15]研究了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對阿爾茨海默病細(xì)胞模型的保護(hù)作用。結(jié)果表明矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化和凋亡相關(guān)基因來保護(hù)阿爾茨海默病細(xì)胞免受Aβ1-40誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。以上研究說明了花色苷可能成為AD等神經(jīng)退行性疾病的潛在候選藥物。此外，最近Isaak等[16]的研究發(fā)現(xiàn)由矢車菊-3-O-半乳糖苷，矢車菊-3-O-葡萄糖苷和矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷組成的越橘花色苷能夠保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的損傷。先前的研究表明了黑果腺肋花楸中花色苷含量非常高，結(jié)構(gòu)簡單，主要由矢車菊-3-O-半乳糖苷，矢車菊-3-O-葡萄糖苷，矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷及矢車菊-3-O木糖苷組成[17]，高純度的花色苷相對更容易分離出來。因此，我們選擇高純度的黑果腺肋花楸花色苷來研究對氧化應(yīng)激相關(guān)的阿爾茨海默病的預(yù)防和保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗所需高純度花色苷請參考Meng等[17]；β淀粉樣肽(1-42)(Aβ1-42,北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；DMEM(10565-018)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS,10099-141)、gluta max(35050061)(美國Gibco公司)；二甲基亞砜(DMSO)(D8371，上海索萊寶公司)；2，3-二甲氧基-1，4-萘醌購(D5439-5MG)、H2O2檢測試劑盒(29300)(中國碧云天公司)；SOD檢測試劑盒(19160)、annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(APOAF-20TST)(美國Sigma公司)；Nrf2抗體(ab62352)、HO-1抗體(ab13248)、NQO1抗體(ab28947)、Bcl-2抗體(ab196495)、Bax抗體(ab32503)、GAPDH內(nèi)參抗體(Sc-32233)、山羊抗兔IgG H&L (HRP,Ab6721)、山羊抗鼠IgG H&L(HRP,Ab6789)(英國Abcam公司)；BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(WLA004,沈陽萬類生物有限公司)；試驗所需引物(沈陽匯佰生物科技有限公司)；TRIzol、TaKaRa試劑盒(美國Gibco公司)；SH-SY5Y細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)。

1.2 主要儀器設(shè)備

倒置顯微鏡(中國奧林巴斯有限公司)；H-2050R型超速冷凍離心機(湖南湘儀離心機有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海SYSBERY儀器有限公司)；iMarkTM型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad有限公司)；Mini-PROTEAN?Tetra型垂直蛋白電泳儀(美國Bio-Rad有限公司)；5200型凝膠成像系統(tǒng)(上海Tianon有限公司)；ExicyclerTM 96型熒光定量儀(韓國BIONEER有限公司)。

1.3 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)及分組

SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含有5% CO2、10% FBS的37 ℃ DMEM培養(yǎng)基中，經(jīng)過復(fù)蘇、傳代，然后保存于4 ℃?zhèn)溆谩９?00 g的溶解于10 mL的DMSO中，得到20 mg/mL的花色苷原液并儲存于4 ℃?zhèn)溆谩９? mg的Aβ1-42溶解于1.8 mL的DMSO中制成257 mM的原液并儲存于4 ℃?zhèn)溆谩；ㄉ占癆β1-42的濃度的篩選，細(xì)胞給藥及細(xì)胞分組參考Meng等[18]的方法，細(xì)胞主要分組如下。

對照組：SH-SY5Y細(xì)胞在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)24 h。

模型組(Aβ1-42組)：將Aβ1-42提前一天放入含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃老化24 h，然后加入SH-SY5Y細(xì)胞中，在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h，終濃度為1 μM。

低劑量藥物保護(hù)組、中劑量藥物保護(hù)組以及高劑量藥物保護(hù)組分別先用20、40、60 μg/mL花色苷預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h，在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h，然后用1 μM Aβ1-42處理，繼續(xù)在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h。所述Aβ1-42已在37 ℃下老化24 h。

1.4 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

1.4.1 細(xì)胞內(nèi)ROS(reactive oxygen species)的檢測

采用2，3-二甲氧基-1，4-萘醌對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行染色，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平。簡而言之，將生長良好且沒有污染的SH-SY5Y細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用適量PBS清洗細(xì)胞表面，并棄去PBS，然后在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用適量胰蛋白酶消化細(xì)胞。待消化完成后，用胰酶2倍體積的完全培養(yǎng)基中止消化，并吹打培養(yǎng)瓶瓶底，將細(xì)胞移入離心管，1 000 rpm離心5 min，去掉上清液，加1 mL完全培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞(沿壁輕輕吹打24次左右)，每孔放入3×105個細(xì)胞，過夜，根據(jù)試驗分組對細(xì)胞進(jìn)行給藥，過夜。爬片的細(xì)胞PBS 2 mL浸洗2次，將2，3-二甲氧基-1，4-萘醌母液稀釋100倍，對已放置在蓋玻片上的細(xì)胞染色15 min，PBS 2 mL浸洗2次，載玻片滴加一滴甘油，將染色好的蓋玻片反扣于甘油上(細(xì)胞面朝下蓋到載玻片上)，透明指甲油封片，熒光顯微鏡200倍觀察，拍照。

1.4.2 細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的檢測

采用SOD測定試劑盒對細(xì)胞內(nèi)SOD進(jìn)行檢測，每個濃度收集1×106個細(xì)胞，用100 μL含1%蛋白酶抑制劑的PBS稀釋，并12 000 rpm離心10 min，取上清。準(zhǔn)備96孔板，每個樣品分為樣品孔和三個空白孔，空白孔1、空白孔2、空白孔3。樣品孔和空白孔2加入20 μL樣品，在空白孔1和空白孔3中加入20 μL ddH2O；每孔加入200 μL WST working solution，并混勻。在空白孔2和空白孔3中加入Dilution Buffer 20 μL。在空白孔1和樣品孔中加入20 μL Enzyme Working Solution。37 ℃孵育20 min，酶標(biāo)儀450 nm處進(jìn)行讀數(shù)。計算公式為：

SOD活性={[(S1-S3)-(SS-S2)]/(S1-S3)}×100%

SS：樣品孔的吸光度值；S1：空白孔1的吸光度值；S2：空白孔2的吸光度值；S3：空白孔3的吸光度值。

1.4.3 細(xì)胞內(nèi)H2O2的檢測

簡而言之，將SH-SY5Y細(xì)胞在裂解緩沖液中裂解并以12 000 rpm離心10 min，棄去沉淀，將上清液儲存在-20 ℃，使用BCA蛋白質(zhì)定量測定試劑盒定量蛋白質(zhì)含量。用H2O2檢測試劑盒測量細(xì)胞內(nèi)H2O2水平，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，樣品中H2O2濃度表示為μmol/g蛋白質(zhì)。

1.5 Annexin-V-PI/FITC 檢測細(xì)胞凋亡

采用Annexin V-PI/FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。簡而言之，用PBS洗滌細(xì)胞，然后棄去PBS。在37 ℃的培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶消化細(xì)胞。然后用完全培養(yǎng)基終止消化，并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中。將細(xì)胞以1 000 rpm離心5 min，棄去上清液。吹打細(xì)胞并與1 mL培養(yǎng)基混合，向每個孔中加入1×106個細(xì)胞并放入培養(yǎng)箱中過夜。根據(jù)實驗組處理細(xì)胞并在孵育24 h后收集。用1×結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮至1×106/mL，并將500 μL細(xì)胞懸浮液加入與5 μL Annexin V FITC和10 μL PI混合于每個流動管中。最后，將反應(yīng)體系在室溫下避光孵育，并使用BD C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)

根據(jù)試驗分組對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行給藥處理。根據(jù)文獻(xiàn)所述提取蛋白質(zhì)[14]。采用BCA蛋白質(zhì)定量測定試劑盒測定蛋白質(zhì)水平，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜，將膜用PBST浸泡，在室溫下轉(zhuǎn)移到封閉溶液中1.5 h，然后與PBST稀釋的一抗鈣調(diào)蛋白、細(xì)胞色素c、caspase-9、裂解的caspase-3、Bcl-2、Bax等抗體(抗體信息見表1)在4 ℃培養(yǎng)過夜(GAPDH為內(nèi)參蛋白)。將膜與二抗以1∶2 000的稀釋度按照上述方式制備，室溫孕育1.5 h，然后用PBST洗滌三次，大約10 min。采用ECL顯色試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用ECL發(fā)光儀器觀察條帶，并用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析。

表1 抗體

1.7 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞表面，棄去PBS，然后在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化完成后，使用完全培養(yǎng)基終止消化，吹打培養(yǎng)瓶底部，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 rpm離心5 min，棄去上清液，用1 mL完全培養(yǎng)基反復(fù)洗滌細(xì)胞三次并用其混合，然后在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。根據(jù)試驗分組對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行給藥處理，并將其置于含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)24 h，然后收集。使用TRIzol從培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞中提取總RNA，并使用TaKaRa試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以通過反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增，反應(yīng)體系為20 μL，其中，cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)(見表2)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，然后ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃，10 min，(95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s)共40個循環(huán)，4 ℃，5 min。最后采用Exicycler 96實時定量熒光檢測器進(jìn)行RT-PCR分析。

表2 熒光定量PCR所用引物

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(ANOVA)法進(jìn)行組間差異顯著性分析，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞內(nèi)ROS的測定

由圖1的結(jié)果我們可以看出，與對照組(control)相比，模型組(Aβ1-42)中的氧自由基明顯增多，說明Aβ1-42能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。此外，與模型組相比，藥物保護(hù)組中的氧自由基明顯減少，而且，隨著藥物保護(hù)組中花色苷(anthocyanins，Ant)劑量的升高，細(xì)胞中的氧自由基也不斷降低。其中，高劑量藥物保護(hù)組(Aβ1-42+Ant(60 μg/mL))細(xì)胞中的氧自由基含量最少，對細(xì)胞的保護(hù)作用最好。說明Ant能夠削弱Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，能夠?qū)?xì)胞起到保護(hù)作用。

圖1 細(xì)胞內(nèi)ROS的測定Fig.1 The determination of intracellular ROS注：紅色：氧自由基生成增多；藍(lán)色：抗氧化作用增加，氧自由基受抑制；G1：對照組；G2：模型組；G3：花色苷干預(yù)組(20 μg/mL)；G4：花色苷干預(yù)組(40 μg/mL)；G5：花色苷干預(yù)組(60 μg/mL)，下同。Note:Red:oxygen free radical production increased;Blue:antioxidant effect increased and oxygen free radical was inhibited;G1:Control group;G2:Model group (Aβ1-42);G3:Aβ1-42+Ant (20 μg/mL);G4:Aβ1-42+Ant (40 μg/mL);G5:Aβ1-42+Ant (60 μg/mL),the same below.

2.2 細(xì)胞內(nèi)SOD的測定

由圖2的結(jié)果可以看出，與對照組相比，模型組的SOD活性顯著低于對照組(P<0.05)，大約降低16.24%。與模型組相比，藥物保護(hù)組中隨著花色苷含量的升高，SOD的活性逐漸顯著升高(P<0.05)，其中，高劑量藥物保護(hù)組(Aβ1-42+Ant(60 μg/mL))的SOD活性最高為99.54%，與模型組相比，SOD活性升高了23.24%。

圖2 細(xì)胞內(nèi)SOD的測定Fig.2 The determination of intracellular SOD注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05).

2.3 細(xì)胞內(nèi)H2O2的測定

從圖3可以看出，與對照組相比，模型組(Aβ1-42)細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生顯著增加(P<0.05)，表明Aβ1-42可誘導(dǎo)H2O2的產(chǎn)生。此外，在藥物保護(hù)組中，隨著花色苷濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生與模型組相比顯著降低(P<0.05)。當(dāng)花色苷濃度為60 μg/mL時，與對照組相比，細(xì)胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生無明顯變化(P>0.05)。這些結(jié)果表明，黑果腺肋花楸花色苷可以減少SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ1-42誘導(dǎo)的H2O2的產(chǎn)生。

圖3 細(xì)胞內(nèi)H2O2的測定Fig.3 The determination of intracellular H2O2注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05).

2.4 細(xì)胞凋亡的檢測

從圖4和表3可以看出，與對照組相比，模型組中早期細(xì)胞凋亡率增加了3.3%，晚期細(xì)胞凋亡率增加了4.5%，細(xì)胞總凋亡率增加了7.8%，表明Aβ1-42可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。與模型組相比，在藥物保護(hù)組中，隨著藥物保護(hù)組中花色苷含量的增加，早期凋亡率，晚期凋亡率和總細(xì)胞凋亡率逐漸降低。當(dāng)花色苷濃度為60 μg/mL時，與模型組相比，總細(xì)胞凋亡率下降了8.3%。這些結(jié)果表明，黑果腺肋花楸花色素苷預(yù)處理能夠有效的削弱Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。

表3 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

圖4 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡Fig.4 The apoptosis in SH-SY5Y cell

2.5 蛋白印記分析

通過蛋白質(zhì)印跡分析Nrf2相關(guān)抗氧化蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在圖5中。與對照組相比，Aβ1-42組中Nrf2、HO-1、NQO1、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Aβ1-42組Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。在藥物保護(hù)組中，隨著花色苷濃度的增加，與模型組相比，Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)逐漸上調(diào)，Bax蛋白的表達(dá)逐漸下調(diào)，當(dāng)花色苷濃度為60 μg/mL時，Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表達(dá)量最高，Bax蛋白的表達(dá)量最低。此外，當(dāng)花色苷濃度為20 μg/ mL時，與對照組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)略有下調(diào)，之后隨著花色苷濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)。當(dāng)花色苷濃度為60 μg/mL時，Bcl-2蛋白表達(dá)量最高。這些結(jié)果說明花色苷能夠激活Nrf2，使其轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)HO-1及NQO1蛋白的表達(dá)。此外，花色苷也能夠促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。

圖5 Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中的凋亡相關(guān)蛋白的蛋白印記分析Fig.5 Western blot analysis of apoptotic-related proteins in Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells

2.6 RT-PCR分析

通過RT-PCR檢測Nrf2相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，詳細(xì)結(jié)果見圖6。從圖中可以看出，與對照組相比，Aβ1-42組中Nrf2、HO-1、NQO1和Bax相對mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，Aβ1-42組中Bcl-2相對mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。在藥物保護(hù)組中，與模型組相比，當(dāng)花色苷濃度為20 μg/mL時，Nrf2相對mRNA表達(dá)下降0.095，隨著花色苷濃度的繼續(xù)增加，Nrf2相對mRNA表達(dá)與模型組相比顯著上調(diào)(P<0.05)。當(dāng)花色苷濃度為20 μg/mL時，NQO1、Bcl-2相對mRNA表達(dá)與模型組相比無顯著變化(P>0.05)，隨著花色苷濃度的繼續(xù)增加，NQO1、Bcl-2相對mRNA表達(dá)相比于模型組顯著上調(diào)(P<0.05)。此外，隨著花色苷濃度的增加，與模型組相比，HO-1相對mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，Bax顯著下調(diào)(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。機體在應(yīng)對氧化應(yīng)激的發(fā)生時形成了一套復(fù)雜的氧化應(yīng)激應(yīng)答系統(tǒng)來應(yīng)對自由基和有毒物質(zhì)的損害，當(dāng)暴露于親電子試劑或活性氧刺激時，機體自身能誘導(dǎo)出一系列的保護(hù)性蛋白，以緩解細(xì)胞所受的損害[19]。這一協(xié)調(diào)反應(yīng)是由保護(hù)性蛋白DNA 上游調(diào)節(jié)區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element，ARE)來調(diào)控的。研究表明，核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通過與ARE 相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[20]。先前的研究已經(jīng)表明了花色苷因其較強的抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)自由基，降低氧化應(yīng)激水平，保護(hù)機體免受氧化應(yīng)激造成的損傷[21-23]。隨著研究的進(jìn)一步深入，研究表明花色苷能夠通過Nrf2信號通路上調(diào)相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)，降低氧化應(yīng)激水平，從而保護(hù)阿爾茨海默病細(xì)胞或者動物模型免受氧化應(yīng)激引起的損傷[24]。

圖6 RT-PCR對Aβ1-42引誘的SH-SY5Y細(xì)胞中相對mRNA表達(dá)分析Fig.6 The relative mRNA expression analysis using Real Time-PCR in Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05).

此外，細(xì)胞凋亡經(jīng)常伴隨氧化應(yīng)激的發(fā)生而發(fā)生，并且哺乳動物細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡通過外在和內(nèi)在途徑進(jìn)行。外在途徑涉及細(xì)胞外信號因子與質(zhì)膜中死亡受體的結(jié)合[25]。內(nèi)在途徑由細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激激活并通過線粒體進(jìn)行。線粒體凋亡途徑受Bcl-2家族的調(diào)節(jié)，Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-xL，以及促凋亡蛋白如Bax和Bak[26]。近年來，研究表明氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡促進(jìn)了AD的發(fā)展。因此，發(fā)掘可以預(yù)防神經(jīng)元氧化損傷和凋亡的生物活性物質(zhì)，從而有助于預(yù)防和控制AD，具有重要的研究意義。

在前言中已經(jīng)介紹了，目前一些研究已經(jīng)報道花色苷能夠通過減少氧化應(yīng)激的發(fā)生以及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡從而對阿爾茨海默病起到預(yù)防和保護(hù)的作用。因此本研究采用Aβ1-42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建阿爾茨海默病細(xì)胞模型系統(tǒng)，選擇ROS、SOD、H2O2作為氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，通過Nrf2信號通路研究花色苷對氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，評價花色苷的細(xì)胞保護(hù)作用。結(jié)果表明了黑果腺肋花楸花色苷能夠激活Nrf2代謝通路，上調(diào)HO-1、NQO1基因mRNA及蛋白的表達(dá)，從而上調(diào)HO-1、NQO1、SOD等相關(guān)抗氧化酶的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。同時，黑果腺肋花楸花色苷還能夠上調(diào)Bcl-2基因及蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax基因及蛋白的表達(dá)，從而降低細(xì)胞的凋亡。因此，黑果腺肋花楸花色苷能夠有效保護(hù)阿爾茨海默病免受Aβ1-42誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡。先前的關(guān)于花色苷對阿爾茨海默病影響的研究大多數(shù)采用的花色苷均為粗提物或者混合物，而本次研究采用的花色苷混合物結(jié)構(gòu)簡單明確，并且純度達(dá)到93%以上，更能夠說明花色苷對阿爾茨海默病的作用，這對于花色苷及其相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)具有重要的意義。