果樹組培生產中真菌污染的表現形式與預防

沈善超，周彩琴，王淑慧，趙文超，袁桂云，范志強

(1.諸城市萬景源農業科技有限公司，山東諸城 262200；2.山東省林業保護和發展服務中心，山東濟南 250014)

在果樹組培生產過程中，污染是威脅實驗室安全生產的關鍵因素，包括細菌性污染和真菌性污染。細菌性污染是可控的，在生產中可以帶菌培養，在處理過程中有較長的緩沖時間。真菌性污染通常是致命的，沒有任何的緩沖時間來處理，發現后只能通過高溫高壓滅菌處理。

真菌性污染在生產中有不同的表現形式，每種表現形式有不同的原因，采取的預防措施也不同。筆者根據多年的組培生產管理經驗，提出了幾種常見的真菌污染表現形式，分析了每種表現形式產生的原因，并提出預防方法，供組培從業人員參考。

1 培養基表面的點狀真菌污染

1.1 表現形式

組培苗接種后，經過一段時間的培養，在培養基表面產生一個或數個真菌菌斑，菌斑很大，非常明顯，主要集中在培養材料基部或周圍(圖1)，培養基其它地方也會有，但比例較少。這種污染是組培室生產過程中最為常見的污染。

1.2 原因和預防

這種少量點狀真菌污染主要是由于選擇母瓶不嚴格造成的，母瓶培養的材料本身已有真菌污染，在操作過程中發生交叉感染；二是操作不規范，工具消毒不徹底。

預防這種污染最重要的是安排專人嚴格挑選無真菌污染的培養材料。挑苗人員應經過嚴格的培訓和長期的實踐，能將普通人員看不到的污染苗挑出來，從而避免交叉感染。規范操作程序可以防止因為人員操作而造成的真菌污染。將已污染的材料挑出來，避免交叉污染。

圖1 培養基出現點狀菌斑

2 培養基表面的彌漫性真菌點狀污染

2.1 表現形式

不同于培養基點狀污染，彌漫性點狀污染是指培養基表面產生大量的真菌菌斑，菌斑不大，但數量較多，比較均勻散布在培養表面的各個部位(圖2)。這種污染一般出現在同一批次滅菌的培養基上，在培養基儲存過程中就會出現污染。但也有批次培養基中個別培養基發現這種污染。

2.2 原因和預防

造成同一批次培養基彌漫性真菌點狀污染的主要原因是培養基消毒不徹底，滅菌鍋溫度壓力的傳感系統出現問題，造成溫度壓力顯示表的數值不正確。如果一個批次中個別培養基發生這種彌漫性污染，原因可能是瓶蓋未擰緊，滅菌過程中因瓶內壓力大沖開瓶蓋，培養基冷卻過快造成瓶內負壓，空氣被迅速壓入培養基中，造成培養基表面彌漫式污染。

避免彌漫性真菌點狀污染，在發現培養基產生這種彌漫性真菌污染后，要立即對滅菌鍋進行檢修，確保滅菌鍋處于正常工作狀態。同批次培養基個別產生這種污染后，要注意培養瓶蓋要擰緊，同時滅菌后不要急于從滅菌鍋中拿出培養基，待培養基冷卻后再取出來。

圖2 彌散性點狀菌斑

3 培養瓶瓶壁瓶蓋散布式少量點狀真菌污染

3.1 表現形式

瓶壁和瓶蓋處有少量的真菌菌斑，特別是近瓶口下面內凹處、瓶口和瓶蓋螺旋口處及瓶蓋內面通氣口附近，特征是菌斑比較小，數量比較少，在瓶壁和瓶蓋處分布不均勻(圖3)。

3.2 原因和預防

造成這種污染的主要原因是培養瓶沒有及時洗刷和充分浸泡，造成干涸的微小培養基顆粒存在于培養瓶的死角處。這種干涸的微小培養基顆粒內部可能包含真菌孢子，在正常的滅菌程序中滅菌不徹底，條件適宜時孢子萌發造成真菌污染。

避免此種污染，要確保培養瓶洗刷前充分浸泡，在洗刷過程中特別注意近瓶口下面內凹處、瓶口和瓶蓋螺旋口處及瓶蓋內面通氣口附近等死角處，保證培養瓶洗刷干凈。

圖3 瓶壁瓶蓋螺紋處點狀真菌

4 培養瓶瓶壁網狀菌絲真菌污染

4.1 表現形式

主要表現在瓶壁上附著有白色網狀菌絲，菌絲面積大小不一，數量不一，分布比較均勻，薄薄的一層，顏色很淺，不易被發現(圖4)。

圖4 瓶壁網狀菌絲真菌

4.2 原因和預防

造成這種方式污染的主要原因是瓶壁上有殘留培養基。當培養瓶使用年限過長，瓶蓋螺旋口可能會出現磨損，瓶蓋上的透氣膜也會發生破裂，造成培養瓶封閉性變差而造成的。這種污染在生產中的危害程度最大，一般不易觀察到，經接種后造成交叉污染。定期更換培養瓶，特別是更換培養瓶蓋可有效解決。