冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清骨形態發生蛋白4，N1-甲基煙酰胺和血管生成素樣蛋白8水平檢測的臨床意義

關小明，陳 鍇，王文會

(佛山市中醫院 a.檢驗科;b.內科;c.心血管內科 ,廣東佛山 528000)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱為冠心病（coronary heart disease，CHD），是心血管疾病中最常見的致死疾病。我國CHD 的患病數約1 100 萬，死亡率約為140/10 萬，并且發病率及患病率有不斷升高的趨勢，嚴重威脅我國人民的健康[1]。CHD常見的危險因素包括高血壓、糖尿病、高血脂等，多種因素共同作用，損傷冠狀動脈血管內皮細胞，導致動脈粥樣硬化的發生[2]。深入研究反映冠脈狹窄程度及病變程度的血清學指標，有助于CHD 的早期診斷及治療效果的評估。血清骨形態發生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP-4）屬于轉化生長因子β 家族成員，研究表明，BMP-4 不僅具有促進成骨的功能，在調控胚胎分化發育、腫瘤發生發展及心血管疾病中均發揮重要的功能[3,4]。N1-甲基煙酰胺（N1-methylnicotinamide，me-Nam)是一種煙酰胺的代謝產物，煙酰胺N-甲基轉移酶（nicotinamide N-methyltransferase，NNMT）可催化甲基從s-腺苷甲硫氨酸向煙酰胺的轉移，產生me-Nam 和s-腺苷同型半胱氨酸。研究顯示，人類血清me-Nam 活性增加與肥胖、糖尿病及CHD 有關，由于肥胖和糖尿病是CHD 發展的危險因素，因此血清me-Nam 水平升高可能參與動脈粥樣硬化的發生發展[5]。血管生成素樣蛋白8（angiopoietin like 8，ANGPTL8）編碼基因位于19p13.2，是一種由肝臟分泌的促炎因子，在CHD 等心血管疾病中存在ANGPTL8 表達上調的現象，其可通過抑制脂蛋白脂肪酶的活性促進動脈粥樣硬化的進展[6]。但目前三者在CHD 中的表達情況及臨床意義尚不清楚，本研究通過檢測CHD 患者血清BMP-4，me-Nam 及ANGPTL8 水平，初步分析三者與血脂、炎癥因子及冠脈病變的關系。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取2018年1月～2020年1月佛山市中醫院收治的86 例CHD 患者為CHD 組。其中，男性53 例、女性33 例，平均年齡為53.61±5.63歲，平均體質量指數（body mass index，BMI）為25.72±3.15kg/m2，并發高血壓史55 例，并發糖尿病史52 例，并發吸煙史33 例。CHD 組根據冠狀動脈的狹窄程度和冠脈病變支數分為三個亞組，其中單支病變組（主要動脈有一支狹窄程度≥50%）25 例，兩支病變組（主要動脈有兩支狹窄程度≥50%）39 例及三支病變組（主要動脈有三支狹窄程度≥50%）22 例；CHD 組中穩定性冠心病21例、急性冠脈綜合征（ACS）65 例，其中急性冠脈綜合癥（acute coronary syndromes, ACS）中包括不穩定型心絞痛47 例和急性心肌梗死18 例。此外，以同期我院健康查體的60例受試者為對照組，其中，男性32 例、女性28 例，平均年齡為54.93±5.30 歲，平均BMI 為24.93±4.21kg/m2，并發高血壓史28 例，并發糖尿病史23 例，并發吸煙史30 例。CHD 組與對照組在年齡、性別、BMI，吸煙史之間相比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）。

CHD 組納入標準：①CHD 的診斷結合患者的臨床癥狀、心肌酶學檢查、冠狀動脈造影等檢查，符合心血管病學分會介入心臟病學組制定的CHD診斷標準，即冠狀動脈15 個不同節段中至少一個節段的管腔狹窄程度≥20%[7]；②CHD 患者及其家屬對本研究知情同意并簽字；③半年內無創傷手術史、心臟疾病治療史等；④受試者簽署知情同意協議。排除標準：①并發其他器官惡性腫瘤；②并發急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病；③近一個月有糖皮質激素、免疫抑制劑的用藥史。

對照組納入標準：①既往無CHD 癥狀及CHD病史；②半年內無創傷手術史、心臟疾病治療史等。排除標準：并發其他器官惡性腫瘤、急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病；③近期有糖皮質激素、免疫抑制劑的用藥史。

1.2 儀器和試劑 BMP-4，me-Nam 和ANGPTL8檢測試劑盒均購自上海穎心生物科技公司（貨號YX80322B，YX80061B 及TX21792）；Beckman Coulter AU5800 全自動生化分析儀及配套試劑盒檢測血生化指標。

1.3 方法

1.3.1 檢驗方法:患者于治療前、體檢者于體檢當日取清晨空腹靜脈血5ml，以3 000r/min 離心10min，離心半徑10cm，取上層血清置于凍存管中，并于-20℃保存，采用酶聯免疫吸附法檢測所有研究對象血清中的BMP-4，me-Nam 和ANGPTL8 水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。應用氧化酶法檢測總膽固醇（total cholesterol，TC），三酰甘油（triacylglycerol，TG）水平；應用酶法檢測高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C），低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；應用乳膠凝集反應法檢測超敏C 反應蛋白（high sensitivity C reactive protein，hs-CRP）水平，白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平檢測采用酶聯免疫吸附實驗進行。

1.3.2 冠狀動脈狹窄程度評價方法:所有患者進行冠狀動脈造影檢查，檢查成功后采用Gensini 積分系統對冠狀動脈狹窄程度進行評價[7]，Gensini 積分=Gensini 評分×各段系數。根據Gensini 積分將CHD 組患者進行分組，Ⅰ組（4～8 分）14 例，Ⅱ組（9～12 分）24 例，Ⅲ組（13～33 分）27 例，Ⅳ組（34 分及以上）21 例。

1.4 統計學分析 使用SPSS23.0 進行研究資料分析。觀測資料中的計量數據，均通過正態性檢驗，以均數±標準差（±s）描述。兩組間的比較為成組t檢驗或校正t檢驗（統計量為t）。多組間的比較為單因素方差分析（統計量為F）+兩兩比較HSD-q檢驗（統計量HSD-q）。趨勢檢驗為兩分類轉化后的Cochran Armitage 趨勢檢驗（統計量為Cochran Armitage 趨勢χ2）。此外，相關分析為Pearson 相關檢驗，ROC 曲線分析血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯合檢測對CHD 組患者的診斷價值。統計推斷的檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CHD 組與對照組血脂及炎癥因子水平比較見表1。與對照組相比，CHD 組患者TC，TG，LDL-C，IL-6，TNF-α 及hs-CRP 明顯較高，HDL-C明顯較低，差異具有統計學意義（均P<0.05）。

表1 CHD 組與對照組血脂及炎癥因子水平比較（±s）

表1 CHD 組與對照組血脂及炎癥因子水平比較（±s）

項 目CHD 組(n=86)對照組(n=60)t 值P 值TC（mmol/L）6.73±0.864.30±0.7217.9330.000 TG（mmol/L）1.51±0.341.03±0.269.6560.000 LDL-C（mmol/L）4.82±0.812.53±0.7017.7530.000 HDL-C（mmol/L）0.96±0.411.32±0.325.9500.000 IL-6 (pg/ml)8.18±2.212.73±0.7318.3980.000 TNF-α(pg/ml)9.24±2.534.52±0.4014.3120.000 hs-CRP（mg/L）1.87±0.350.71±0.1328.0840.000

2.2 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini積分對比 見表2，表3。與對照組相比，CHD 組患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平明顯增高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。三支病變組患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8，Gensini 積分明顯高于單支及雙支病變組患者，雙支病變組患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8，Gensini 積分高于單支病變組患者，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 CHD 組與對照組血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 積分對比（±s）

表2 CHD 組與對照組血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 積分對比（±s）

項 目對照組（n=60）CHD 組（n=86）t 值P 值BMP-4（μg/L）3.12±1.276.67±1.7514.201 0.000 me-Nam（ng/ml）5.21±1.439.74±2.6013.495 0.000 ANGPTL8（μg/L） 150.33±29.63 502.12±79.34 37.538 0.000 Gensini 積分-32.73±6.10--

表3 不同狹窄程度組血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 積分對比（±s）

表3 不同狹窄程度組血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及Gensini 積分對比（±s）

注：*與對照組相比，P<0.05；#與單支病變組相比，P<0.05；&與雙支病變組相比，P<0.05。

指標對照組（n=60）單支病變組（n=25）雙支病變組（n=39）三支病變組（n=22）差異分析趨勢分析FPχ2P BMP-4（μg/L）3.12±1.275.18±1.35*6.24±1.57*#9.13±2.14*#&93.6960.00080.9760.000 me-Na(ng/ml）5.21±1.438.31±2.71*9.79±2.50*#11.30±2.83*#&55.5150.00075.6880.000 ANGPTL8(μg/L）150.33±29.63468.94±84.72*503.34±75.81*#537.66±81.94*#&359.2590.000108.6410.000 Gensini 積分-25.73±7.1334.73±6.11#37.14±8.05#&--

2.3 不同冠狀動脈狹窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比較 見表4。隨著Gensini積分升高，CHD 患者的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 有逐漸升高的趨勢（均P＜0.05）。

表4 不同冠狀動脈狹窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比較（±s）

表4 不同冠狀動脈狹窄程度的血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平比較（±s）

注：*與Ⅰ組比較，P ＜0.05；#與Ⅱ組比較，P ＜0.05，&與Ⅲ組比較，P ＜0.05。

指標Ⅰ組（n=14）Ⅱ組（n=24）Ⅲ組（n=27）Ⅳ組（n=21）差異分析趨勢分析FPχ2P BMP-4(μg/L）5.25±1.036.04±1.13*6.81±1.11*#8.16±1.14*#&22.7920.00026.6820.000 me-Nam(ng/ml）7.22±1.828.73±1.97*10.09±2.03*#12.09±2.19*#&18.9280.00018.9550.000 ANGPTL8(μg/L)343.01±89.06420.54±74.75*564.57±79.12*#623.46±80.85*#&48.3340.00049.2520.000

2.4 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8水平與血脂、炎癥因子和Gensini 積分的相關性 見表5。CHD 組患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 表達與Gensini 積分, TC, TG, LDL-C, IL-6, TNF-α 及hs-CRP 呈正相關，與HDL-C 呈負相關（均P<0.05）。

表5 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平與血脂、炎癥因子和Gensini 積分的相關性

2.5 CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8表達的相關性 Pearson 線性相關分析結果CHD患者血清BMP-4 表達與me-Nam，ANGPTL8 表達呈顯著正相關（r=0.567，0.610，P=0.000，0.000），me-Nam 與ANGPTL8 的表達呈顯著正相關（r=0.562，P=0.000）。

2.6 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯合檢測對CHD 的診斷價值 見圖1。血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯合檢測的敏感度分別為70.3%，75.3%，78.6% 及87.3%，特異度分別為63.1%，72.2%，70.9%及62.4%。ROC 曲線分析顯示，血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯合檢測的曲線下面積分別為0.707（95%CI:0.601～0.812），0.713（95%CI:0.612～0.833），0.759（95%CI:0.667～0.850）及0.847（95%CI:0.722～0.908），聯合診斷的診斷效能大于任一單一指標的診斷效能。

圖1 血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 及聯合檢測對CHD 的診斷價值

3 討論

CHD 是嚴重威脅人類健康的心血管疾病，近年來隨著我國經濟發展水平的提高及人口老齡化的加劇，其發病率不斷升高[8]。病理上，CHD 主要表現為動脈粥樣硬化及粥樣硬化斑塊的形成，伴有血管內皮細胞的損傷、單核巨噬細胞的浸潤及泡沫細胞的形成。CHD 的發生和促炎與抗炎系統平衡失調有關，涉及血清白介素、基質金屬蛋白酶等多種炎癥及炎癥因子的異常改變，導致血管內皮細胞的增殖、血管膠原蛋白的降解，促進CHD 的發生發展[9]。因此，有必要尋找反映CHD 病情嚴重程度的血清標志物，探討其在CHD 發病中的作用，為CHD 的早期診斷、風險評估及治療提供新的思路。

BMP-4 是骨形態發生蛋白家族成員，主要在脈管系統中廣泛表達，近年來研究發現，BMP-4 是血管穩態和疾病的關鍵調節因子，BMP-4 能夠促進血管內皮細胞氧化的作用，并導致一氧化氮依賴性血管舒張受損，引起內皮細胞功能障礙[10]。本研究中，CHD 組患者血清BMP-4 水平較對照組人群均明顯升高，提示BMP-4 可能參與促進CHD 的發生發展。此外，CHD 患者冠狀動脈狹窄程度越重或病變支數越多，血清BMP-4 水平越高。SUCOSKY等[11]學者報道，CHD 時血管內皮細胞處于氧化應激的狀態，大量活性氧誘導BMP-4 的表達上調，BMP-4 作為一種促炎因子，能夠結合白細胞表面的細胞間黏附分子1，促進白細胞的的黏附、聚集及活化，加重冠脈的病變程度，促進CHD 的病變進展。本研究中，BMP-4 與血脂相關指標TC，TG，LDL-C 及炎癥因子IL-6，TNF-α 及hs-CRP 呈正相關，與HDL-C 呈負相關，表明BMP-4 還可能參與CHD 中脂質代謝的生物學過程。目前BMP-4 對脂質代謝調節的機制尚不清楚，WEI等[12]學者發現，BMP-4 能夠誘導脂肪干細胞向成熟的脂肪細胞進行分化，發生CHD 時BMP-4 可能通過結合細胞表面的BMPR-IA 受體，激活下游信號通路，促進冠狀動脈脂質浸潤和內皮損傷，導致CHD 的病變進展。

me-Nam 作為一種反映尼克酰胺-N-甲基轉移酶（NNMT）活性的血清學指標，主要在脂肪組織和肝臟中高表達，在其他器官組織中低表達。研究表明，肥胖癥和2 型糖尿病小鼠和人類的NNMT活性增加，而肥胖和糖尿病是CHD 疾病發生發展的重要危險因素[13-14]。因此，可以推測CHD 患者血清me-Nam 水平可能影響CHD 的疾病進展。本研究中，CHD 患者冠狀動脈狹窄程度越重或病變支數越多，血清me-Nam水平越高。MATEUSZUK等[15]研究證明，me-Nam 具有改善血管內皮細胞功能，抑制血小板活化和抑制炎癥的作用，并且在載脂蛋白E/LDL 雙敲除小鼠中顯示出抗動脈粥樣硬化作用。DOMAGALA 等[16]研究發現，me-Nam 能通過增加內皮細胞中內皮型一氧化氮合酶介導的一氧化氮的釋放來改善內皮功能障礙。因此，CHD 患者中血清me-Nam水平的增加可能作為一種防御反應，me-Nam 通過改善血管內皮功能障礙增加適應動脈粥樣硬化的能力，導致動脈粥樣硬化的程度不斷加重。此外，me-Nam 水平與TC，TG，LDL-C，IL-6，TNF-α 及hs-CRP 呈正相關，與HDL-C 呈負相關，表明me-Nam 與CHD 中脂質代謝及炎癥途徑關系密切。PISSIOS 等[17]發現，me-Nam 通過抑制活性氧的產生而具有抗炎特性和抗血栓的特性，對動脈粥樣硬化中內源性me-Nam 通路的激活能夠抑制動脈粥樣硬化的發生，因此CHD 中血清me-Nam表達升高可能作為一種炎癥反應補償機制，增強機體抗炎能力。

ANGPTL8 主要表達于肝臟及脂肪組織中，結構上缺乏C 端的纖維蛋白原樣結構域，在N 端與ANGPTL3 和ANGPTL4 具有共同的卷曲螺旋結構域。研究表明，ANGPTL8 參與炎癥調節、脂肪代謝、葡萄糖代謝及動脈粥樣硬化等病理生理過程，并影響疾病的發生發展，可能是反映病情的重要標志物[18]。本研究發現，CHD 組患者血清ANGPTL8水平高于對照組，且血清ANGPTL8 水平與冠狀動脈的狹窄程度、病變支數有關，可能是ANGPTL8能促進膽固醇吸收的主要受體巨噬細胞清除受體1的表達，促進巨噬細胞中膽固醇的攝取并抑制膽固醇外排，促進泡沫細胞的形成[19]。尚有研究發現，ANGPTL8 能夠通過增加血漿TG 水平，促進動脈粥樣硬化的發生[20]。本臨床研究亦證實，CHD 組患者血清ANGPTL8 表達與血脂相關指標TC，TG，LDL-C 呈正相關，與HDL-C 呈負相關。因此，血清ANGPTL8 的高表達參與CHD 患者機體內脂質代謝的病理生理學過程，但具體機制有待深入研究。

本研究分析CHD 患者血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8 水平的相關性，結果三者之間存在顯著正相關，三者之間的相互關系目前尚不清楚，結合本研究，三者可能通過參與調節慢性炎癥因子的產生，影響脂質代謝的生物學過程，導致CHD 病情的發生發展。本研究進一步分析三者對CHD 的診斷價值，結果聯合檢測對CHD 的診斷效能明顯升高，表明聯合檢測可能有助于CHD 的早期診斷，值得臨床深入探索。

綜上所述，血清BMP-4，me-Nam，ANGPTL8水平在CHD 患者中表達升高，冠狀動脈狹窄程度越重或病變支數越多，其水平越高，且三者與CHD 患者血脂、炎癥因子有關，檢測其水平可為CHD 病情評估提供一定參考。