非小細胞肺癌放化療聯合靶向治療對血清腫瘤標志物、免疫功能及Cyclin D3水平影響的相關研究

王 旋，崔立春，黨升強

（長安醫院腫瘤科，西安 710016）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是鱗狀肺癌、肺腺癌等大細胞肺癌的統稱，約占所有肺癌的80%，與小細胞癌相比，具有腫瘤細胞生長較慢的特點[1]。目前非小細胞肺癌臨床治療研究進展緩慢，非小細胞肺癌手術患者五年生存率僅為20%以內[2]。靶向治療是隨著基因學發展而發展起來的，如針對非小細胞肺癌表皮生長因子受體突變的表皮生長因子受體-轉氨酶抑制劑(如吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼等)被廣泛應用于非小細胞肺癌治療，再如針對變性淋巴瘤激酶(denatured lymphoma kinase,DLK)融合基因重排的阿來替尼、布加替尼等也被廣泛應用于非小細胞肺癌治療，另外對于無基因突變的抑制血管生成藥物(如貝伐珠單抗、安羅替尼等)，這些靶向治療藥物應用均可獲取到較高的應答率，可顯著提升非小細胞肺癌患者的無疾病進展生存期[3-5]。本項研究帶著非小細胞肺癌臨床工作實踐中的實際問題，觀察放化療聯合靶向治療在非小細胞肺癌中的應用，并分析其對病情相關因子的影響，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 項目獲得醫院倫理委員會的批準。以2014年6月～2017年1月長安醫院收治的136例非小細胞肺癌病例為前瞻性研究對象。病例納入標準：①接受培美曲塞+卡鉑化療和放射治療；②年齡不低于18 歲，且至少有一處可測量的轉移病灶；③無任何(或有效控制)的嚴重全身系統性基礎疾病，如心臟系統疾病、肝臟細胞疾病、免疫系統疾病等；④接受實驗化療方案前，腫瘤患者體力狀態評分低于2 分，且預計生存時間不低于3 個月；⑤自愿接受臨床醫師推薦本研究治療方案，簽署化療知情書。病例排除標準：①妊娠期婦女和哺乳期婦女；②有任何嚴重的(或未能有效控制的)全身性系統疾病。③接受實驗方案前，腫瘤患者體力狀態功能評分高于2 分者，且預計生存時間低于3 個月者。病例脫失標準：①因任何原因失訪者和轉院者；②中途要求終止實驗方案的依從性不佳者；③中途改變臨床實驗方案者。根據患者就診先后順序從1～136 編號，采用巢式對照研究法分組：以確診為非小細胞肺癌為研究起點，將接受化療、放射聯合靶向治療的病例納入放化療聯合靶向組，放化療聯合靶向組每入組1 例病例，選擇最近時間基線資料(包括人口學資料：年齡、性別；病情情況：病理分型、轉移部位、腫瘤患者體力狀態評分；實驗室指標：白細胞計數、中性粒細胞、血小板、血紅蛋白)相匹配的接受單純化療、放射的病例納入單純放化療組，最終研究時限內放化療聯合靶向組和單純放化療組均分別納入病例68 例。放化療聯合靶向組和單純放化療組在人口學資料(年齡、性別)、病情情況(病理分型、轉移部位、腫瘤患者體力狀態評分)、實驗室指標(白細胞計數、中性粒細胞、血小板、血紅蛋白)等基線資料上比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

1.2 儀器與試劑 貝克曼CytoFLEX 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；熒光免疫分析儀購自北京科思佳科技有限責任公司；糖類抗原125(caccharide antigen 125,CA125)，糖類抗原153(caccharide antigen 153,CA153)，端粒酶(telomerase59,TRIM59)，環氧化酶(cycloxygenase,COX)，癌胚抗原(Carcinoembryonic,CEA)，細胞角蛋白21-1(cytokeratin 21-1,cyfra21-1)，鱗癌抗原(squamouse cell carcinoma antigen,SCC)，細胞周期蛋白D3(D3 of cyclin,Cyclin D3)，分化簇3( cluster differentiation 3,CD3)，分化簇4(cluster differentiation 4,CD4)，分化簇 8( Cluster Differentiation 8,CD8)，免疫球蛋白A(immunoglobulin A IgA)，免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)，免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)等試劑盒購自上海心語生物科技。

1.3 方法 單純放化療組予以培美曲塞+卡鉑化療(每周1 次)聯合和放射治療(每周1 次)。放化療聯合靶向組在化療和放射治療基礎上予以靶向藥物(吉非替尼、或克唑替尼、或貝伐珠單抗)治療。以療效評價指標、血清相關指標及不良反應作為療效和安全性評價指標。①療效評價指標包括無疾病進展生存時間和總生存時間。②血清相關指標包括腫瘤標志物、免疫相關指標和Cyclin D3，均于治療前和治療3 個月時抽血檢測，腫瘤標志物和Cyclin D3 采用FIA-102 熒光免疫分析儀以熒光免疫分析法檢測，免疫相關指標采用貝克曼CytoFLEX流式細胞儀檢測。③安全性評價。以NCI-CTCAE version 4.0[6]為評估標準，統計白細胞減少、中性粒細胞減少、血小板減少等不良事件發生情況。

1.4 統計學分析 以SPSS17.0數據統計分析工具，以P<0.05 為差異具有統計學意義。年齡、總生存時間、血小板計數等資料采用均數±標準差（±s）描述，不良反應率等資料用頻數描述，采用t檢驗、χ2檢驗、秩和檢驗等進行組間差異分析；繪制生存時間Kaplan-Meier 曲線，并采用log-rank 檢驗分析生存期差異。

2 結果

2.1 療效綜合評價分析 截止2019年10月31日，放化療聯合靶向組和單純放化療組患者除死亡病例(放化療聯合靶向組4 例，單純放化療組8 例)外，均未因嚴重藥物不良反應而終止治療或轉院等情況，未出現研究病例脫落。Kaplan–Meier曲線見圖1。放化療聯合靶向組的無疾病進展生存時間(6.1±1.2月)長于單純放化療組 (4.8±0.9月)，經log-rank檢驗差異具有統計學意義(95% CI:3.880～8.781，t=6.563，P=0.003<0.05)。放化療聯合靶向組平均總生存時間(13.6±1.8月)長于單純放化療組(11.3±1.4月)，經log-rank 檢驗差異具有統計學意義(95%CI:2.674～12.429，t=7.639，P=0.019<0.05)。

圖1 放化療聯合靶向組和單純放化療組生存期的Kaplan–Meier 曲線

2.2 腫瘤標志物及Cyclin D3 表達分析 見表1。非小細胞肺癌標志物(CA125，CA153，TRIM59，COX，CEA，cyfra21-1，SCC) 及Cyclin D3 表達數據顯示。治療前，放化療聯合靶向組和單純放化療組的標志物比較，差異均無統計學意義(t=0.108～0.617，均P>0.05)；與治療前比較，治療后放化療聯合靶向組和單純放化療組腫瘤標志物均下降，但放化療聯合靶向組標志物下降幅度高于單純放化療組，差異具有統計學意義(t=8.615～21.816，均P<0.05)。

表1 放化療聯合靶向組和單純放化療組腫瘤標志物情況分析(±s,U/ml）

表1 放化療聯合靶向組和單純放化療組腫瘤標志物情況分析(±s,U/ml）

項目單純放化療組(n=68)放化療聯合靶向組(n=68)治療前治療后tP治療前治療后tP CA125(U/ml)56.91±3.1636.84±2.1624.384<0.00156.79±3.1624.56±1.7626.492<0.001 CA153(U/ml)36.43±2.6329.68±1.9311.348<0.00136.37±2.5620.31±1.5620.515<0.001 TRIM59(U/ml)59.74±4.3147.61±3.1214.156<0.00159.38±4.6634.15±2.4223.814<0.001 COX(U/ml)42.74±3.3832.34±2.8910.874<0.00142.58±3.5824.18±2.1924.474<0.001 Cyclin D3(ng/ml)14.11±1.8410.01±1.437.081<0.00114.28±1.776.71±1.0819.386<0.001 CEA(μg/L)18.79±2.7114.23±2.178.263<0.00118.89±2.8010.21±1.8216.715<0.001 cyfra21-1(ng/ml)34.92±3.0926.09±2.6814.021<0.00134.89±3.1219.62±2.1917.815<0.001 SCC(μg/ml)3.62±0.872.72±0.625.814<0.0013.79±0.832.09±0.3914.814<0.001

2.3 免疫功能指標分析 見表2。T 細胞亞群指標(CD3+，CD4+，CD4+/CD8+)和免疫球蛋白指標(Ig G，Ig A，Ig M)數據顯示:治療前，放化療聯合靶向組和單純放化療組的T 細胞亞群指標和免疫球蛋白指標比較，差異無統計學意義(P>0.05) ；與治療前比較，治療后放化療聯合靶向組和單純放化療組的T細胞亞群指標和免疫球蛋白指標均提升，但放化療聯合靶向組標志物提升幅度高于單純放化療組，差異具有統計學意義(t=11.617～26.384，均P<0.05)。

表2 放化聯合靶向組和單純放化療組的免疫功能指標分析分析(±s）

表2 放化聯合靶向組和單純放化療組的免疫功能指標分析分析(±s）

項目單純放化療組(n=68)放化聯合靶向組((n=68)治療前治療后治療前治療后CD3+(%)58.43±1.9163.29±2.0358.52±1.9378.18±2.23 CD4+(%)46.29±1.5355.18±1.8346.38±1.5263.84±2.09 CD4+/CD8+0.97±0.131.14±0.160.98±0.141.28±0.21 Ig G(U/L)8.61±1.5612.59±1.868.52±1.9378.18±2.23 Ig A(U/L)1.23±0.322.08±0.441.26±0.343.01±0.69 Ig M(U/L)0.86±0.211.20±0.320.88±0.201.64±0.4

2.4 安全性分析 放化療聯合靶向組和單純放化療組全部患者均接受血液毒性評估，統計3 級、4 級等強血液毒性不良反應情況(見表3)。放化療聯合靶向組和單純放化療組在白細胞減少率、中性粒細胞減少率、血小板減少率、惡心率、嘔吐率等不良藥物反應上比較，差異無統計學意義(χ2=0.000～0.697,均P≥0.05)。

表3 放化聯合靶向組和單純放化療組的化療藥物3～4 級不良反應比較[n（%）]

3 討論

高發病率、高病死率使肺癌成為全球醫學界臨床研究的熱點。最新2018年數據顯示：2018年全球累計新發肺癌病例380 萬，相比2017年的340萬，增長了11.7 %[7]，同時肺癌患者5年生存率很低，約在20%左右，遠遠低于其余三大惡性腫瘤(乳腺癌為67.8%，胃癌為71.2 %、結腸癌為64.3%)[8-9]。非小細胞肺癌是鱗狀肺癌、肺腺癌等大細胞肺癌的統稱，是肺癌中最常見類型，放化療是治療的主要方案。近年靶向治療在非小細胞肺癌治療中也得到廣泛應用，主要包括三個方面：①對于表皮生長因子受體EGFR 突變非小細胞癌，可使用吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、奧希替尼等靶向治療[10]，70%以上的NSCLC 患者能夠獲得臨床病情控制[11]；②對于間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因重排的非小細胞肺癌，主要采用克唑替尼、阿來替尼、布加替尼等藥物靶向治療[12]，具有臨床療效較佳，副作用小的優勢、在非小細胞肺癌的臨床治療中取得了矚目療效[13-14]；③對于無明顯基因突變的非小細胞癌，可采用抑制血管生成藥物，如貝伐珠單抗、安羅替尼等靶向治療[15]，可使非小細胞肺癌患者近期(9 個月)的病情客觀緩解率(客觀控制率)達70%左右[16]。本研究將放化療聯合靶向治療方案應用于非小細胞肺癌，結果顯示：與單純放化療方案相比，放化療聯合靶向治療非小細胞肺癌并未出現更多臨床不良反應，但可獲得更長的無疾病進展生存時間、總生存時間的臨床收益。到目前為止，放化療聯合靶向治療方案治療非小細胞肺癌可獲得較高的臨床收益這已經得到研究證實，國外學者FOSSELLA 等[17]的研究顯示，放化療輔助以靶向治療方案，可改善非小細胞肺癌的總生存期。

放化療聯合靶向治療非小細胞肺癌可取得較佳臨床療效的機制研究涉及較少，從本研究結果來看其機制可能有兩個方面：其一，與單純放化療方案相比，放化療聯合靶向治療方面可改善非小細胞肺癌患者的癌標志物表達水平。本研究中與治療前比較，治療后放化療聯合靶向組和單純放化療組的標志物及Cyclin D3 均下降，但放化療聯合靶向組標志物及Cyclin D3 下降幅度高于單純放化療組(P<0.05)。CA125，CA153 均為糖類抗原，其高表達可激活蛋白激酶的活性，促進腫瘤細胞分裂、增殖和轉化，是包括非小細胞肺癌在內的多種癌癥的重要標志物[18]。TRIM59 是由RNA 和蛋白質組成的核糖端粒酶，TRIM59 的激活或高表達可導致細胞無限增殖，是體細胞向腫瘤轉化中的關鍵因子，近年已經成為非小細胞肺癌的標志物之一[19]。環氧化酶（COX）是一種雙功能酶，不僅是具有過氧化氫活性酶，也是體細胞向腫瘤轉化的催化物質，COX 也可促進乳腺癌細胞增殖和抑制細胞凋亡。癌胚抗原（CEA）最初發現于結腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原，CEA 升高常見于大腸癌、胃癌、肺癌等[20]。cyfra21-1 目前被認為是一種主要用于檢測肺癌的腫瘤標記物，尤其對非小細胞肺癌的診斷具有重要價值，若肺部存在不清晰的環形陰影，同時血清人細胞角質片斷21-1（CYFRA21-1）濃度>30ng/ml，非小細胞肺癌的可能性非常高[21]。SCC異常高表達常見于鱗癌，同時異常高表達也見于宮頸癌、肺癌、卵巢癌等[22]，目前均為臨床常用非小細胞癌標志物。近年來，Cyclin D3 異常表達在多種腫瘤發病過程中的作用頗受臨床關注，報道中顯示Cyclin D3高表達可促進非小細胞肺癌病情進展，使Cyclin D3 成為非小細胞肺癌病因學研究中的熱點[23-24]。綜合既往研究結果及本研究結果來看，放化療聯合靶向治療非小細胞肺癌，可抑制非小細胞癌腫瘤標志物及Cyclin D3 的高表達，這可能為放化療聯合靶向治療方案可取得較佳臨床收益的一個作用機制。其二，與單純放化療方案相比，放化療聯合靶向治療方面可改善非小細胞肺癌患者的免疫功能。

本研究中，與治療前比較，治療后放化療聯合靶向組和單純放化療組的T 細胞亞群指標和免疫球蛋白指標均提升，但放化療聯合靶向組標志物提升幅度高于單純放化療組(P<0.05)。Th1 淋巴細胞可分泌出CD4，CD3 等免疫應答產物，均是重要的免疫相關因子；而Th2 主要分泌CD8，其高度分泌可促進炎性因子分泌，對T 淋巴細胞的免疫功能產生影響[25]。另外免疫球蛋白是機體黏膜防御系統的重要組成部分，可有效抑制腫瘤細胞在黏膜組織中的復制，對于大部分腫瘤細胞均具有抗體活性。如IgM 是機體免疫防御體系中不可或缺的組成部分，也是增強機體免疫力抵抗腫瘤細胞侵襲的重要物質[26]，同時Ig G 和Ig A 也具有相似的功能[27]。可見，免疫功能在非小細胞肺癌臨床治療效果提升中的作用不言而喻，結合本研究結論來看，與單純放化療方案相比，放化療聯合靶向治療非小細胞肺癌，可顯著改善非小細胞肺癌患者免疫功能，這也有可能是放化療聯合靶向治療方案可取得較佳臨床收益的另一個作用機制。

綜上所述，與單純放化療方案相比，放化療聯合靶向治療非小細胞肺癌并未出現更多臨床不良反應，同時也可改善腫瘤標志物、免疫功能及Cyclin D3 等病情相關指標表達，使其獲得更長的無疾病進展生存時間、總生存時間的臨床收益，故值得臨床推廣。但是，本研究也存在一定的局限性，如在臨床隨機分組設計中，雖然盡可能排除了研究結果干擾因素，但由于臨床病例收集困難，可能使研究結果存在有一定的偏倚，這個局限性希望后續研究能進一步證實。