ECE2通過上調E2F1和MYC來促進乳腺癌細胞的增殖和遷移

顧芯燁，吳旦平，江 波，商江峰，蔣國勤，魏金榮，李 華

（1.常熟市第一人民醫院甲乳外科，江蘇常熟 215500；2.蘇州大學附屬第二醫院普外科，江蘇蘇州 215004；3.府谷縣人民醫院，陜西榆林 719400）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，以手術為主的綜合療法是其臨床主要治療方法[1-2]。近年研究發現，乳腺癌是由上皮細胞惡性轉化形成，在此過程中多種基因蛋白及信號通路參與其中[3]。越來越多證據也表明，腫瘤的發生和發展與基因或蛋白的異常表達有關，多種基因或蛋白可在表觀遺傳學層面調控基因的表達，參與腫瘤的發生進程[4]。并指出人類惡性腫瘤中存在多種基因或蛋白異常表達，可調控癌細胞的生物學行為及轉錄激活/抑制，與臨床病理及預后關系密切[5]。目前，基于分子生物學探究腫瘤發生發展的分子機制是近年腫瘤研究領域的熱點，也為臨床腫瘤的研究治療提供了新的方向。故深入探究找尋新的生物分子標志物并探究其在乳腺癌中的作用，對乳腺癌的臨床診治及預測預后具有積極意義。內皮素轉化酶（ECE）是II 型膜金屬肽酶，因其具有將無活性的前體大內皮素轉化為有效的血管活性肽內皮素1 的能力而命名[6]。ECE1和ECE2具有59%的序列同源性并切割相似的底物，其中ECE1 在中性pH 下最活躍，ECE2 在弱酸性pH 下最活躍[7]。目前，ECE2 在癌癥中的研究報道鮮少，而本研究前期經檢索GEPIA[8]臨床數據庫篩選乳腺癌特異性靶基因時發現ECE2 基因在乳腺癌中表達異常，與乳腺癌臨床病理分級及預后關系密切，提示其在乳腺癌發生發展中可能扮演某種角色發揮重要作用。因此，本研究擬通過設計體外細胞試驗探究ECE2 在乳腺癌中表達及對乳腺癌細胞增殖、克隆形成、遷移和細胞周期的影響和潛在分子機制，以期為臨床靶標的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年9月～2019年9月于常熟市第一人民醫院行手術治療的20 例乳腺癌患者腫瘤組織及其癌旁正常組織（距癌灶邊緣>5cm）標本，所有組織均由手術獲取，快速行冰凍病理檢查確認后低溫保存備用。人乳腺癌細胞系MCF7 購于中國科學院細胞庫，放入含10ml/dl胎牛血清的DMEM 培養液培養，加入鏈霉素100 μg/ml 和青霉素100 IU/ml，37℃，5ml/dl CO2培養箱培養。

1.2 儀器及試劑 胎牛血清購自上海薇宏生物科技有限公司；DMEM 培養液購自美國Hyclone 公司；MTS 試劑購自南京凱基生物技術有限公司；酶標儀購自美國賽默飛公司；Annexin V-PI 細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Lipo2000 購自美國Invitrogen 公司等。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉染：待密度達到80%左右進行細胞轉染，參照Lipo2000 說明書進行，轉染后37 ℃，5ml/dl CO2，95%濕度條件下常規培養2 天，收集細胞用于后續實驗。轉染分組：轉染無義SiCTL 序列的細胞作為對照組(SiCTL 組)，轉染2 條ECE2 SiRNA序列細胞分別作為SiECE2#1 組和SiECE2#2 組。

1.3.2 細胞增殖實驗：取消化后細胞以適當濃度鋪于96 孔板，每組設3 個復孔；37℃，5ml/dl CO2孵育待細胞貼壁后進行轉染，48 h 后測量吸光度。按照MTS∶培養液=1∶20 比例配制MTS 反應液，每孔加入MTS 反應液100 μl，37℃分別繼續培養0，24，48 和72 h 后在490 nm 處測量各孔的吸光度值，繪制細胞增殖曲線。

1.3.3 克隆形成實驗：取轉染后各組細胞適當濃度鋪于6 孔板，每孔設3 個復孔，培養6～14 天待出現肉眼可見的克隆時收集細胞，PBS 洗滌兩次，0.5g/dl 結晶紫甲醇溶液固定15 min，水洗、晾干、掃描、10g/dl醋酸溶液溶解結晶紫，在590 nm 處測吸光度值。

1.3.4 劃痕遷移實驗：取消化后細胞鋪于6 孔板，細胞貼壁后進行轉染，待生長到90%用槍頭在孔板中央劃痕，PBS 沖洗，培養0，24 h 拍攝照片觀察。1.3.5 細胞周期實驗：取消化后細胞重懸于PBS溶液，吹散、滴加等體積預冷無水乙醇，振蕩混勻，4 ℃靜置12～24 h，3 000 g 離心3 min，棄上清，重復一次；加入500μl PI/Triton X-100 染液[Triton X-100(0.10%)5μl，DNA Sefree RNA see A(sigma)2mg, PI(40μg/ml)10μl, 補ddH2O 至500μl]37 ℃孵育15 min，行DNA 染色，過濾成簇細胞，避光保存上機實驗分析。

1.3.6 基因功能分析：在cBioPortal[9]臨床數據庫中找到與ECE2 共表達（相關性r>0.4）的基因，后拷貝在metascape 數據庫中進行Hallmark 和KEGG信號通路分析。

1.3.7 細胞增殖回補實驗：取消化后細胞鋪于96 孔板，37℃，5ml/dl CO2孵育待細胞貼壁后進行轉染siCTL，siECE2，siECE2+E2F1 和siECE2+MYC，每孔設3 個復孔；每孔加入MTS 反應液100μl，繼續培養，在490 nm處測量吸光度值，繪制細胞增殖曲線。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0 軟件進行實驗結果分析，所有實驗數據均采用均數±標準差（±s）表示，多組間采用one-way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；乳腺癌組織及臨近正常組織數據比較采用配對t檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ECE2 在乳腺癌組織中的表達 采用qRT-PCR法檢測20 例臨床乳腺癌組織樣本，發現乳腺癌組織中ECE2 表達量（30.342±6.564）顯著高于癌旁組織（21.753±8.244），差異有統計學意義（t=7.484，P＜0.001）。

2.2 敲低ECE2 對乳腺癌細胞增殖、克隆形成，遷移及細胞周期的影響 敲低ECE2 顯著抑制乳腺癌細胞增殖、克隆形成和遷移，阻滯細胞周期在G1期。通過靶向轉染敲低乳腺癌中ECE2 表達，見圖1a。經檢測發現siECE2#1 組（0.232±0.016）和siECE2#2 組（0.214±0.014）細胞中ECE2 mRNA表達明顯低于對照組（1.000±0.010），差異有統計學意義（F=756.347，P＜0.001），提示成功轉染敲低ECE2 表達。

細胞增殖實驗見表1，圖1b。轉染24，48和72 h后，對照組、siECE2#1 組、siECE2#2 組在490nm 處的吸光度值差異均有統計學意義（P<0.05）。克隆形成實驗見圖1c。siECE2#1 組（0.515±0.014）和siECE2#2組（0.511±0.006）細胞克隆形成速率顯著低于對照組（3.473±0.147），差異有統計學意義（F=467.152，P＜0.001）。劃痕遷移實驗見圖1d。siECE2#1 組（56.423±1.137） 和siECE2#2 組（42.036±0.754）細胞遷移愈合速率顯著低于對照組（78.124±1.352），差異有統計學意義（F=805.162，P＜0.001）。細胞周期實驗見圖1e。與對照組（69.99%）相比，siECE2#1 組（81.34%）和siECE2#2 組（83.38%）細胞周期顯著阻滯在G1 期，以上結果說明ECE2 在乳腺癌發展進程中發揮促癌作用。

表1 不同時間點各組細胞吸光度值(±s)

表1 不同時間點各組細胞吸光度值(±s)

注：各時間點①組與②③組比較，差異有統計學意義P ＜0.05；②③組比較差異無統計學意義（P ＞0.05）。

時 間（h）siCTL 組①siECE2#1 組②siECE2#2 組③FP 240.203±0.0190.092±0.0110.083±0.00971.409<0.001 480.482±0.0230.224±0.0170.219±0.012211.681<0.001 720.824±0.0260.456±0.0200.376±0.019357.545<0.001

圖1 敲低ECE2 對乳腺癌MCF7 細胞增殖、克隆形成、遷移及細胞周期的影響

2.3 ECE2 正調控E2F1 和MYC 表達 通過metascape 數據庫分析與ECE2 共表達的基因，Hallmark信號通路顯示ECE2 促進乳腺癌的生長可能是因其影響E2F1 和MYC 表達（P＜10-2），見圖2a。同時KEGG 信號通路也發現ECE2 可顯著影響細胞周期(P＜10-4，見圖2b）。經檢測20 例臨床組織樣本，發現乳腺癌組織中E2F1（1.534±0.316）和MYC（1.323±0.214）表達水平顯著高于癌旁組織樣本（0.542±0.125 和0.347±0.239），差異均有統計學意義（t=13.055，13.606，均P<0.001），見圖2c。qRT-PCR 檢測顯示，siECE2#1 組（0.373±0.018）和siECE2#組（0.352±0.015）細胞中E2F1 mRNA表達水平明顯低于對照組（1.012±0.013），差異有統計學意義（F=703.020，P＜0.001）；siECE2#1組（0.415±0.017）和siECE2# 組（0.396±0.016）中MYC mRNA 表達水平也明顯低于對照組（1.014±0.012），差異有統計學意義（F=613.395，P＜0.001），見圖2d。蛋白免疫印跡實驗檢測顯示：siECE2#1 組（0.485±0.044） 和siECE2# 組（0.287±0.035）細胞中E2F1 蛋白表達低于對照組（1.057±0.086），差異有統計學意義（F=136.301，P＜0.001）；siECE2#1 組（0.557±0.048） 和siECE2#組（0.557±0.048）細胞中MYC 蛋白也顯著低于對照組（1.048±0.079），差異有統計學意義（F=102.573，P＜0.001），見圖2e。提示ECE2可正向調控E2F1，MYC 表達，其可能通過調控E2F1，MYC 表達進而促進乳腺癌發生發展。

圖2 ECE2 調控乳腺癌發生發展的作用驗證

2.4 ECE2 通過上調E2F1 和MYC 表達促進乳腺癌生長 研究在敲低ECE2 表達效果顯著的siECE2#2組細胞中分別回補E2F1 和MYC，發現在敲低ECE2 表達的細胞中重新過表達E2F1 和MYC 后，細胞增殖速率又回歸正常水平，見圖3。各組吸光度值見表2。進一步說明ECE2 主要通過促進E2F1和MYC 的表達從而促進乳腺癌的發展進程。

表2 不同時間點各組細胞吸光度值(±s)

表2 不同時間點各組細胞吸光度值(±s)

注：24，48，72 h 時，②組分別與①③④組相比，均P<0.05；各時間點①③④組差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

時 間（h）siCTL ①siECE2#2 ②siECE2#2+E2F1 ③siECE2#2+MYC ④F P 24 0.203±0.0190.083±0.0090.247±0.0220.213±0.01947.699<0.001 48 0.482±0.0230.219±0.0120.554±0.0250.532±0.026145.659<0.001 720.824±0.0260.376±0.0190.933±0.0290.867±0.030277.221<0.001

圖3 回補實驗驗證

3 討論

研究前期為找尋乳腺癌新的分子靶基因，通過GEPIA 數據庫篩選發現相比于291 個鄰近正常組織，有1 085 個乳腺癌組織中ECE2 顯著高表達，且發現隨著乳腺癌臨床分期越高癌組織中ECE2 表達水平越高，與乳腺癌惡性程度呈正相關；ECE2高表達乳腺癌患者五年預后生存率為73.5%，明顯低于其低表達患者的94.8%（LogrankP=0.0053），提示ECE2 基因高表達在乳腺癌發生發展中應扮演某種重要角色。既往研究發現，ECE2 主要在神經組織中表達，主要在錐體神經元中被檢測到，星形膠質細胞和小膠質細胞中也有少量表達[6]。ECE2四個亞型都位于細胞內分泌囊泡中，均能夠在輕度酸性條件下降解細胞內神經肽[7]。ECE2 基因編碼變異可用于識別阿爾茨海默病[10]。ECE2 在人類皮層發育過程中調節神經發生和神經元遷移[11]。而目前關于ECE2 的表達和功能研究較少，其在乳腺癌中的表達作用尚不明確，故進一步探究其對乳腺癌細胞生物學行為的影響對臨床乳腺癌的研究具有重要意義。本研究經檢測20 組乳腺癌臨床組織樣本中ECE2 表達，發現既往數據庫結果一致均顯著高于正常組織，暗示ECE2 在乳腺癌發生發展進程中發揮致癌基因屬性。根據ECE2 的臨床特征研究探究了其在乳腺癌中的功能及其分子機制，轉染siRNA 介導敲低乳腺癌MCF7 細胞中ECE2 表達，經體外細胞增殖實驗、克隆形成實驗、劃痕遷移實驗及細胞周期實驗探究發現，敲低ECE2 表達后MCF7 細胞增殖率、克隆形成速率及細胞遷移速率均顯著減慢，促使細胞周期顯著阻滯在G1 期，證實了ECE2 高表達的致癌性；接著研究利用與ECE2 共表達基因參與的信號通路發現ECE2 可調控促癌基因E2F1 和MYC 的表達，故進一步探究了其與E2F1 和MYC 基因間的相互調控作用。

目前，已在哺乳動物細胞中鑒定出8 種E2F因子，并按其發現順序編號為E2F1-8[12]。在人類乳腺癌中，E2F 被認為具有復雜的作用。據報道，E2F1 表達上調參與了乳腺癌的癌變，其結果是參與了Nanog 表達的抑制[13]。LIU 等[14]報道，轉錄因子E2F1 與HBXIP 共表達發揮激活作用，誘導PKM2 表達，進而促進雌激素受體陽性（ER+）乳腺癌細胞的增殖。抑制E2F1 可抑制MCF7 細胞增殖并誘導其凋亡[15]；E2F1 及其與組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）的復合物在下調乳腺癌細胞中抑癌基因ARHI 的表達中起重要作用[16]，表示E2F1 在乳腺癌中發揮致癌作用，與以上報道一致的是，本研究發現敲低ECE2 在乳腺癌細胞中的表達后，E2F1表達顯著降低，導致乳腺癌細胞生長增殖速率減慢；但在敲低ECE2 表達的乳腺癌細胞中回補E2F1，細胞增殖速率又回歸正常水平，說明ECE2 促進乳腺癌進程主要通過調控E2F1 來實現。

原癌基因c-MYC 控制細胞增殖與細胞死亡之間的平衡[17]。致癌基因c-MYC 通過蛋白質的基本螺旋與Max 蛋白形成異源二聚體，調節靶基因的轉錄活性，包括代謝酶和細胞周期調節劑，如細胞周期蛋白D2[18]。此外，c-Myc 的表達上調會影響腫瘤發生，例如c-Myc 過度表達與乳腺癌，NSCLC和前列腺癌有關[19-21]。本研究發現敲低ECE2 表達后乳腺癌細胞中MYC 表達也顯著降低，導致乳腺癌細胞生長增殖速率減慢，但在敲低ECE2 表達的乳腺癌細胞中回補MYC，細胞增殖速率又回歸正常水平，進一步說明了ECE2 促進乳腺癌進程也可通過調控MYC 來實現。然而腫瘤的發生發展是多基因、多通路共同作用的結果，癌基因參與調控腫瘤進程的分子機制復雜，故ECE2 在乳腺癌中的表達調控作用機制還需通過更深入的信號分子通路進一步研究探明。

綜上所述，ECE2 在乳腺癌中高表達導致促癌靶基因E2F1 和MYC 顯著高表達，從而促進乳腺癌細胞生長增殖、克隆形成和遷移，并縮短細胞周期G1 進程，從而導致乳腺癌的發生發展。