MTHFR基因多態性與脊髓亞急性聯合變性的相關性分析

陳靜非，徐志昊，高媛雪，李建剛，魚 海，張建軍，侯瑞華

(寶雞市中心醫院神經內科，陜西寶雞 721000)

脊髓亞急性聯合變性（subacute combined degeneration，SCD）是一種主要累及脊髓側索和錐體束的神經系統變性疾病，臨床上多表現為雙下肢深感覺缺失、感覺性共濟失調、痙攣性癱瘓及周圍性神經病變。長期以來，維生素B12（vitamin B12，VitB12）缺乏被認為是本病最主要的致病原因，其機制在于VitB12 參與神經系統甲基化過程，可影響髓磷脂合成，長期缺乏會導致神經脫髓鞘及軸索變性改變[1-2]。但是，臨床工作中常發現部分SCD 患者無確切VitB12 缺乏證據，提示可能還存在其他潛在致病原因。有研究發現SCD 患者血清同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平顯著升高[3]，而Hcy 水平過高可反饋性抑制甲基化過程[4]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸代謝通路的關鍵酶之一，為Hcy提供甲基形成甲硫氨酸。近年來，相繼有研究發現MTHFR 基因存在多個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點可影響MTHFR 正常生理功能，進而影響機體Hcy表達和代謝[5-8]。本研究將觀察SCD 患者血清VitB12，葉酸、Hcy 和MTHFR 基因多態性的關系，旨在探討MTHFR 基因多態性與SCD 發病的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 連續性選擇2017年1月～2020年7月于寶雞市中心醫院神經內科診治的85 例SCD 患者作為病例組，其中男性49 例，女性36例，平均年齡56.77±10.82 歲。納入標準：①年齡≥18 歲；②SCD 診斷參考HEMMER 等[9]提出的診斷標準。排除標準：①血清檢測前3月內應用過VitB12 和（或）葉酸治療；②并發嚴重肝腎功能障礙、惡性腫瘤等；③妊娠期婦女。選擇同期于我院體檢的健康志愿者100 例作為對照組，其中男性55 例，女性45 例，平均年齡57.03±9.66 歲，對照組成員均接受詳細問診排除脊髓疾病可能。病例組和對照組性別、年齡差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 7900 HT 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司），Unicel Dxl 800 Access 免疫分析系統（美國Beckman Coulter 有限公司），日立7170A 分析儀（日本日立有限公司），VitB12 及葉酸檢測試劑盒（美國貝克曼庫爾特有限公司），Hcy 檢測試劑盒（北京康思潤業生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 基因多態性檢測：本研究采用熒光定量PCR 法檢測MTHFR 基因C677T 和A1298C 位點多態性。引物均購至生工生物工程（上海）股份有限公司，C677T 位點上游引物：5’-GAA AAGCTGCGTGATGATG-3’；下游引物：5’-TTGA AGGAGAAGGTGTC-3’。A1298C 位點上游引物：5’-AAGAACGAAGACTTCAAA-3’； 下游引物：5’-TGGGGGGAGGAGCTGAC-3’。將PCR 擴增產物移至熒光定量PCR 儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用分析軟件確定各樣本的基因型結果。

1.3.2 血清VitB12，葉酸和Hcy 水平檢測：所有研究對象在接受VitB12 治療之前空腹采集5ml 靜脈血，3 000 r/min，離心5 min。血清VitB12 和葉酸均按化學發光免疫法進行檢測；血清Hcy 則按循環酶法進行檢測。本研究定義血清VitB12濃度＜180pg/ml 為VitB12 缺乏、血清葉酸濃度＜3.1 ng/ml為葉酸缺乏、血清Hcy 濃度＞15μmol/L 為高Hcy。

1.4 統計學分析 采用SPSS19.0 統計軟件分析處理，計數資料結果以構成百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗。多因素分析采用二元Logistic 回歸分析法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般臨床資料比較 見表1。病例組貧血、VitB12 缺乏和高Hcy 發生率均高于對照組，差異具有統計學意義（均P＜0.01）。

表1 兩組基線資料比較[n(%)]

2.2 兩組MTHFR 基因C677T 和A1298C 位點基因型和等位基因分布頻率比較 見表2。研究對象C677T 和A1298C 位點上的基因型和等位基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（均P＞0.05），具有群體代表性。兩組C677T 和A1298C 位點基因型和等位基因分布頻率差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 兩組MTHFR 基因C677T 和A1298C 位點基因型分布和等位基因頻率比較[n(%)]

2.3 兩位點不同基因型與血清VitB12，葉酸和Hcy 水平的關系 見表3，表4。MTHFR 基因C677T 位點和A1298C 位點不同基因型人群VitB12 缺乏和葉酸缺乏發生率差異均無統計學意義（均P＞0.05）；兩位點不同基因型人群高Hcy 發生率差異具有統計學意義（均P＜0.01）。

表3 C677T 位點不同基因型與血清VitB12，葉酸和Hcy 水平的關系[n(%)]

表4 A1298C 位點不同基因型與血清VitB12，葉酸和Hcy 水平的關系[n(%)]

2.4 多因素分析 見表4。采用二元Logistics 回歸法分析SCD 發病的獨立危險因素，以單因素分析P＜0.05 的參數為自變量，包括貧血、VitB12 缺乏、高Hcy，C677T 位點TT 基因型和A1298C 位點CC基因型，但由于Hcy 升高是MTHFR 基因突變的直接結果，故從自變量中剔除；以SCD 發病為因變量，結果顯示攜帶C677T 位點TT 基因型是SCD 發病的獨立危險因素（OR=2.768，95% CI：1.487～5.516，P=0.005），A1298C 位點基因多態性與SCD 發病無明確相關性（OR=2.190，95% CI：0.958～5.004，P=0.067）。

表4 SCD 易感性的多因素分析

3 討論

目前，多數研究一致認為早期診斷和及時治療是改善SCD 預后的關鍵因素，一般在發病的前三個月內經積極治療和康復鍛煉，SCD 患者預后相對較好，部分患者甚至可達到完全恢復，而當進展到病程后期時，即使給予相應治療，仍然療效欠佳，多數患者可能遺留的部分神經功能障礙不能恢復[10]。因此，對可疑SCD 患者在發病早期及時篩查和治療對患者預后具有重要臨床意義。長期以來，VitB12 缺乏仍是SCD 最為公認的假說之一，本研究結果同樣顯示病例組患者血清VitB12 平均水平顯著低于對照組。但臨床中經常出現部分SCD 患者無確切VitB12缺乏證據，甚至因此貽誤診治時機，影響患者預后。因此，繼續深入探討該病發病機制和分子遺傳學背景具有重要的臨床價值。

近年來，多個研究結果表明高Hcy 可能與SCD發病相關，其機制尚未明確，可能在于Hcy 過多蓄積會反饋性抑制機體甲基化反應，繼而導致核酸代謝和髓鞘合成受損[3-4,10]。MTHFR 是參與Hcy 轉化為蛋氨酸的關鍵酶，其在DNA 合成和甲基化過程中也起著重要作用[13]。C677T（rs1801133）和A1298C（rs1801131）是MTHFR 基因最常見的SNP位點，研究顯示攜帶突變基因個體的MTHFR 酶活性可明顯降低。因此，研究認為C677T T 等位基因和A1298C C 等位基因與DNA 甲基化減少和Hcy濃度增加有關[5]。目前已有多項研究發現C677T 和A1298C 基因多態性與各類疾病有關，如出生缺陷、阿爾茨海默病、卒中、惡性腫瘤等[5,13-14]。近期一項研究以中國北方漢人為研究對象，結果顯示攜帶C677T TT 基因型可增加SCD 患病風險，但該研究僅納入31 例SCD 患者，且僅觀察C677T 一個SNP位點[15]。此外，既往研究表明不同地區、種族人群MTHFR 基因多態性位點基因型分布頻率存在明顯差異，如歐洲和北美人群C677T 位點TT 純合子頻率為5%～15%，遠低于中國人20%～25%[16-17]。在國內不同地域不同民族之間，兩位點基因型分布和等位基因頻率也不一致，有薈萃分析結果顯示以秦嶺-淮河為界，中國北方人群C677T TT 基因型和T 等位基因頻率均高于南方人群，而A1298C CC 基因型和C 等位基因分布頻率均低于南方人群[18]。因此，有必要繼續開展相關研究以驗證和進一步探討MTHFR 基因多態性與SCD 的相關性。

本研究結果顯示攜帶C677T 位點TT 基因型可顯著增加SCD 發病風險（OR=2.768，95% CI：1.487～5.516，P=0.005），與ZHANG 等[15]研究結果相符。同時，本研究還發現C677T 位點不同基因型之間高Hcy 發生率存在顯著差異，尤其攜帶TT基因型人群顯著高Hcy 發生率高于CC 基因型人群，驗證了本研究的前期推測，即MTHFR 基因突變可導致MTHFR 酶活性下降，進而降低5-亞甲基四氫葉酸濃度，抑制Hcy-甲硫氨酸再甲基化，導致Hcy 在體內不斷蓄積，使核酸代謝和髓鞘合成受損，導致SCD 發病。此外，本研究結果還顯示A1298C位點不同基因型之間高Hcy 發生率也存在顯著差異，但本研究未發現該位點基因多態性與SCD 明顯相關，一方面可能與該位點突變基因頻率偏低，樣本量相對較少，檢驗效能不足有關，另一方面也表明了SCD 發病機制的復雜性。

綜上所述，本研究發現在陜西地區漢族人群中，MTHFR C677T 多態性與SCD 易感性密切相關。本研究還有一定的局限性：首先，由于SCD 患病率相對較低，本研究納入的樣本量偏少。其次，如前所訴，不同地域不同民族患者該基因兩位點多態性分布頻率均存在一定差異，因此有必要繼續在多區域開展研究。第三，SCD 的其他潛在危險因素，包括其他MTHFR 多態性，需要進一步研究。最后，本研究未就MTHFR 基因多態性與神經功能障礙嚴重程度和預后進行觀察，也需要進一步闡明。