TUBA1C促進人肺腺癌細胞系增殖和遷移的機制研究

王利民，劉 鍇

（河北省中醫(yī)院腫瘤科 石家莊 050011）

據最新癌癥統(tǒng)計數據，肺癌是臨床最常見的癌癥類型及癌癥死亡首要原因，主要以非小細胞肺癌居多，其中腺癌是非小細胞肺癌的主要類型[1-2]。在過去的幾十年中，肺癌的病理結構逐漸改變，肺腺癌成為最流行的亞型，約占肺癌總數的70%，尤其是在東亞[2-3]。并有數據顯示，以實性或亞實性結節(jié)為特征的早期肺腺癌的比例顯著增加[4]。因此研究專注于肺腺癌的發(fā)生發(fā)展及其潛在發(fā)病機制，對其臨床治療具有積極意義。TUBA1C 是與微管結構相關的α-微管蛋白亞型，微管結構是一種多功能細胞骨架蛋白，參與關鍵的細胞作用，在有絲分裂和細胞分裂過程中必不可少[5]。研究表明TUBA1C 與許多癌癥的細胞增殖和細胞周期有關，其表達上調可以顯著影響腫瘤的生長和進展[6-7]。并發(fā)現，TUBA1C 是細胞周期信號通路中的關鍵中介，在多種惡性腫瘤中異常表達，參與腫瘤的增殖、遷移及侵襲，是腫瘤靶向治療的新靶標[5,7-8]。基于此本研究擬探究TUBA1C 在肺腺癌中的表達作用機制，以期為臨床肺腺癌的診治提供新的研究靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象 人肺腺癌細胞系A549 購于中國科學院細胞庫，含10ml/dl 胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液，同時加入青霉素（100 IU/ml）和鏈霉素（100μg/ml），在37℃，5ml/dl CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑 胎牛血清、DMEN 培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司；Lipo2000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；MTS 反應液購自南京凱基生物技術有限公司；酶標儀購自美國Bio-rad 公司；胰酶購自美國Gibco 公司；流式細胞儀購自美國Beckman Coulter 公司；兔抗人E2F1 單克隆抗體、兔抗人MYC 單克隆抗體購自英國Abcam 公司；青霉素、鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臨床數據庫篩選：在臨床數據庫GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)[9]中探索目的蛋白的表達特征以及臨床預后相關性。

1.3.2 細胞轉染：取對數生長期細胞以1×106/孔濃度接種于6 孔板，待細胞融合度達80%～90%時按照Lipo2000 試劑盒說明書進行轉染。

1.3.3 細胞增殖實驗：取轉染培養(yǎng)后各組細胞消化、重懸，5×103個/孔接種于96 孔板，每孔設3 個生物重復，37℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)箱孵育48 h；按照MTS∶培養(yǎng)液=1∶20 比例配制MTS 反應液，每孔加入100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；采用酶標儀在490 nm處測量各孔吸光度值，繪制細胞增殖曲線，實驗重復3 次。

1.3.4 克隆形成實驗：取對數生長期各組細胞胰酶消化吹打制成單個細胞，將細胞懸浮在含10ml/dl胎牛血清DMEN培養(yǎng)液中；細胞懸液梯度倍數稀釋，接種于10 ml 預溫培養(yǎng)液皿，37℃ 5ml/dl CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～14 天至出現肉眼可見克隆時終止培養(yǎng)；收集細胞，PBS 洗滌兩次，4g/dl 多聚甲醛固定15 min，0.5g/dl 結晶紫染色15 min，水洗直至背景紫色洗掉，室溫晾干；倒置培養(yǎng)皿疊加一張透明膠片，于顯微鏡下計數克隆數，計算克隆形成速率。

1.3.5 劃痕遷移實驗：取轉染培養(yǎng)后各組細胞胰酶消化，重懸，調整細胞密度為2×105個/ml 接種于6 孔板培養(yǎng)過夜；次日用10 μl 移液器槍頭垂直于6孔板在每孔底部劃線，加入無血清培養(yǎng)液分別培養(yǎng)0 和24 h，于倒置顯微鏡下觀察、拍照，測量細胞劃痕寬度，計算細胞遷移率。

1.3.6 細胞周期實驗：收集對數生長期各組細胞胰酶消化到離心管，3 000 g離心3 min，收集細胞沉淀，預冷PBS 洗滌2 次重懸，滴加等體積預冷的無水乙醇，吹打混勻，靜置24 h；細胞離心收集固定細胞，PBS 洗滌，加入500 μl PI/Triton X-100 染液[Triton X-100(0.10%)5μl, DNAsefree RNAsse A(sigma)2mg,PI(40μg/ml)10μl,補dd H2O 至500μl)]避光孵育30 min，于流式細胞儀上進行檢測分析。

1.3.7 蛋白質免疫印跡實驗：收集轉染后各組細胞加入裂解液進行裂解，提取細胞總蛋白并測定其濃度和純度；取40 μg 蛋白樣品制樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜，5g/dl 脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入待測蛋白稀釋一抗室溫孵育4h，搖床洗膜3 次，4℃過夜；次日去除多余一抗，洗膜4 次，加入標記二抗室溫孵育1 h，洗膜4 次，每次5 min，暗房顯影。1.3.8 基因功能分析：通過cBioPortal[10-11]臨床數據庫找到與TUBA1C 共表達的基因，利用metascape 進行信號通路分析，找尋TUBA1C 可能參與癌癥進程發(fā)揮功能的通路。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 25.0 對實驗結果進行分析，實驗數據采用均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用one-way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗；癌組織及癌旁正常組織中基因表達差異比較采用配對t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TUBA1C 在肺腺癌中的表達屬性 見圖1。研究通過檢索GEPIA 數據庫發(fā)現，較相比鄰近正常組織，肺腺癌組織中TUBA1C 顯著高表達（P<0.05）（圖1a），且高表達與預后差具有明顯的臨床相關性（Logrank P=9.3e-5）（圖1b）；30 組肺腺癌臨床樣本中TUBA1C 表達水平（6.4±1.3）顯著高于癌旁正常組織（5.2±0.9），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.157，P＜0.001），且隨著癌癥的不斷惡化，TUBA1C 表達逐漸升高（P=0.003 49）（圖1c）。

圖1 TUBA1C 在肺腺癌中的表達屬性

2.2 TUBA1C 促進肺腺癌細胞增殖和遷移 見圖2。qRT-PCR 檢測顯示，與對照siCTL 組（1.02±0.13）相比，siTUBA1CA#1 組（0.25±0.06）和siTUBA1 CA#2 組（0.22±0.08） 細胞中TUBA1C 相對表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=68.799，P<0.001），表明轉染siRNA 介導敲低TUBA1C 表達的細胞系構建成功，可用于后續(xù)實驗。細胞實驗檢測顯示，轉染培養(yǎng)3，4 和5 天時siTUBA1CA#1組和siTUBA1CA#2 組細胞增殖A值明顯低于對照組（F=7.000～27.780，均P＜0.05）（見圖2a，表1）。siTUBA1CA#1 組（41.2±1.5）和siTUBA1 CA#2 組（40.3±1.3）細胞克隆形成率明顯低于對照組（72.4±2.2），差異有統(tǒng)計學意義（F=342.482，P＜0.001）（如圖2b）；兩實驗組細胞遷移率為73.4±3.2 和72.1±2.8，也明顯低于對照組（98.6±1.7），差異有統(tǒng)計學意義（F=95.778，P＜0.001）（圖2c）；兩實驗組細胞周期為52.7%和50.1%，較對照組（41.8%）顯著阻滯在G1 期（圖2d）。

圖2 TUBA1C 促進肺腺癌細胞增殖和遷移

表1 不同培養(yǎng)時間點各組細胞增殖A 值比較（±s）

表1 不同培養(yǎng)時間點各組細胞增殖A 值比較（±s）

時間（天）siCTL 組siTUBA1CA#1 組siTUBA1CA#2 組FP 1 0.20±0.010.20±0.030.19±0.020.2140.813 2 0.32±0.030.28±0.040.28±0.031.4120.314 3 0.41±0.040.31±0.020.33±0.047.0000.027 4 0.52±0.030.36±0.040.37±0.0321.265＜0.001 5 0.61±0.050.39±0.030.40±0.0427.780＜0.001

2.3 TUBA1C 激活E2F1 和MYC 的表達 見圖3。通過metacape 網站分析與TUBA1C 共表達基因參與的信號通路，發(fā)現TUBA1C 可能參與調控E2F1和MYC 的表達，從而促進肺腺癌細胞增殖和遷移（圖3a）。細胞實驗驗證發(fā)現，siTUBA1CA#1組（0.21±0.02，0.33±0.03）和siTUBA1CA#2 組（0.20±0.03，0.36±0.02）細胞中E2F1 和MYC mRNA 表達水平較對照組（1.01±0.03，1.00±0.02）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=883.773，758.294，均P＜0.001）（圖3b）；同時E2F1 和MYC 的蛋白水平也顯著降低（圖3c）。

圖3 TUBA1C 激活E2F1 和MYC 的表達

2.4 TUBA1C 通過激活E2F1 和MYC 的表達促進肺腺癌細胞增殖和遷移 見圖4，表2。回補實驗驗證發(fā)現，敲低TUBA1C 顯著抑制肺腺癌細胞的增殖和遷移，同時將細胞周期顯著阻滯在G1 期。但在敲低TUBA1C 表達的肺腺癌細胞中分別回補E2F1 和MYC 以及共回補E2F1 和MYC 后，細胞增殖速率（圖4a）、遷移速率（圖4b）以及細胞周期（如圖4c）較單純敲低TUBA1C 組相比均逐漸恢復正常（P<0.01），證明TUBA1C 通過激活E2F1和MYC 的表達促進肺腺癌細胞的增殖和遷移。

圖4 TUBA1C 通過激活E2F1 和MYC 的表達促進肺腺癌細胞增殖和遷移

表2 不同培養(yǎng)時間點各組細胞增殖A 值比較（±s）

表2 不同培養(yǎng)時間點各組細胞增殖A 值比較（±s）

注：與siCTL 組相比，*P<0.05.

時間（天）siCTL 組siTUBA1CA 組 siTUBA1CA+ E2F1 組 siTUBA1CA+ MYC 組 siTUBA1CA+ E2F1+MYC 組FP 10.20±0.010.20±0.020.21±0.010.20±0.030.22±0.021.0910.412 20.32±0.030.25±0.030.30±0.020.30±0.010.40±0.0216.556＜0.001 30.41±0.040.32±0.030.39±0.030.39±0.020.52±0.0316.691＜0.001 40.52±0.030.36±0.020.50±0.040.50±0.030.63±0.0329.426＜0.001 50.61±0.050.38±0.030.58±0.040.58±0.030.74±0.0433.240＜0.001

3 討論

肺腺癌是非小細胞肺癌最常見的組織學亞型，目前盡管有多種方法可以治療，但其臨床死亡率仍較高[12]。因此，尋找新的治療目標以改善治療方法至關重要。本研究經檢索GEPIA 數據庫發(fā)現肺腺癌中TUBA1C 顯著高表達，惡性程度越高其表達水平越高，具有高表達預后差特征，暗示TUBA1C在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的致癌作用。因此研究通過分子生物學細胞研究對TUBA1C 在肺腺癌細胞中的作用進行了驗證，首先研究在肺腺癌細胞中通過轉染陰性干擾序列siRNA 介導敲低TUBA1C 表達，分別通過細胞增殖、遷移、克隆實驗及細胞周期實驗驗證了TUBA1C 對肺腺癌細胞生物學行為的影響，發(fā)現敲低TUBA1C 表達明顯抑制了肺腺癌細胞的增殖、遷移及克隆形成率，阻滯細胞周期在G1 期，提示TUBA1C 在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌作用。故進一步探究其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的致癌作用分子機制具有重要意義。

研究通過分析與TUBA1C 共表達基因參與信號通路發(fā)現，TUBA1C 可能參與調控經典致癌基因E2F1 和MYC。E2F 是第一個被發(fā)現與腫瘤抑制因子pRB 結合的細胞蛋白，當與pRB 家族成員結合時，E2Fs 充當轉錄抑制因子，而游離的E2Fs 激活轉錄[13]。E2F1 是E2F 之一，并且已知在不同的信號傳導途徑（例如細胞周期，細胞自我更新，分化和凋亡）中上調靶基因[14]。E2F1 在肝細胞癌、膠質母細胞瘤、胰腺癌[15-17]等許多癌癥中被下調，而在黑色素瘤的淋巴結轉移中經常發(fā)現E2F1 的過度表達[18]。在具有促進腫瘤作用的功能之后，E2F1 的表達與腫瘤細胞的增殖和抗凋亡相關[19]。c-MYC 癌蛋白在腫瘤發(fā)生中起著重要作用[20]。正常細胞中，c-MYC的表達受到轉錄和轉錄后機制的嚴格控制[21]。通過基因擴增，染色體易位或插入誘變，c-MYC 在一半以上的人類癌癥（包括肺癌、乳腺癌和結腸癌）中被激活[22]。使用細胞培養(yǎng)和小鼠模型進行的廣泛研究已很好地表征了c-MYC 的強致癌活性[23]。既往研究已證明c-MYC 控制基因組中10%～15%基因的表達[20]。最近研究也表明c-MYC 是已經活躍的啟動子的全局擴增子[24]。通過調節(jié)靶基因的表達，c-Myc 可調節(jié)多種細胞過程，包括細胞增殖、分化、代謝和基因組不穩(wěn)定性[25]。而本研究通過細胞實驗驗證發(fā)現，敲低TUBA1C 表達明顯降低了E2F1和MYC mRNA 蛋白表達水平，說明在肺腺癌細胞中TUBA1C 正調控E2F1 和MYC 表達，因此猜測TUBA1C 可能通過激活E2F1 和MYC 從而促進肺腺癌細胞增殖和遷移。為進一步驗證該猜測，研究經細胞回補實驗發(fā)現，敲低TUBA1C 表達的細胞在回補E2F1 和MYC 后其細胞增殖、遷移速率及細胞周期較單純TUBA1C 低表達組明顯恢復，證實TUBA1C 通過激活E2F1 和MYC 的表達從而促進肺腺癌細胞增殖和遷移、誘導細胞凋亡，參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，TUBA1C 通過激活E2F1 和MYC的表達促進肺腺癌細胞增殖和遷移、誘導細胞凋亡，參與肺腺癌的惡性發(fā)展進程。