肝細胞型藥物性肝損傷患者全基因組關聯分析

黎鶯輝 劉永萍 李東良

藥物性肝損傷（DILI）是指由各類藥物、保健品、生物制劑、膳食補充劑及其代謝產物乃至輔料所引發的肝損傷，是最嚴重和最常見的藥品不良反應之一，嚴重者可導致肝衰竭，乃至死亡［1-3］。近年來，藥物性肝損傷的發病率及致死率有逐年升高的趨勢，目前DILI的發病率已經躍居肝臟疾病中的第三位［4］。DILI的發病機制復雜且個體差異大，不同個體DNA序列存在多態性，而這種多態性可能導致其對應基因的功能發生改變，從而導致DILI的發生。DILI根據受損靶細胞可分為肝細胞型、膽汁淤積型、混合型、肝血管型，其中以肝細胞型最為常見［5］，而不同分型的DILI可能發病機制有所差異。全基因組關聯分析（GWAS）是利用芯片在全基因組水平上檢測與疾病相關的易感位點、區域和相關基因。本研究利用Illumina SNP芯片對肝細胞型DILI患者DNA進行GWAS，以期發現與肝細胞型DILI發病有關的易感基因，進而揭示DILI的發病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1月至2019年12月本院診斷為肝細胞型DILI 30例（病例組），男14例，女16例，平均年齡為（48.6±10.62）歲。均符合《藥物性肝損傷診治指南（2015年版）》的診斷流程和要點；采用指南推薦的RUCAM評分量表對DILI患者進行評分，選取RUCAM評分≥6分的DILI患者；根據患者入院時血清谷丙轉氨酶（ALT）和堿性磷酸酶（ALP）計算R值，即R=（血清ALT實測值/正常值上限）/（ALP實測值/正常值上限），R≥5為肝細胞型，2≤R<5為混合型，R<2為膽汁淤積型。另選擇同時期體檢健康者30例為對照組，男15例，女15例，平均年齡（45.8±15.64）歲。兩組間均無血緣關系，無其他肝膽系統疾病，如病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病、遺傳性肝病、膽囊結石等；不伴有高血壓、糖尿病、精神神經疾病等具有遺傳傾向或患有遺傳病；不伴有嚴重免疫缺陷。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義。

1.2 方法 （1）DNA抽提：所有受試者抽取EDTA抗凝靜脈血3 mL保存在-20 ℃冰箱，提取血細胞DNA保存在-80 ℃冰箱［6］。（2）全基因組掃描：將提取的DNA外送上海歐易生物醫學科技有限公司，由該公司按照芯片說明書完成DNA與Illumina Global Screening Array芯片雜交，獲得的樣本原始數據利用GenomeStudio（V2011.1，Illumina）進行分析，獲取每個樣本基因型數據［7］。（3）數據處理和關聯分析：應用Plink（version1.9）軟件過濾基因型缺失<10%，最小等位基因頻率<0.01，Hardy-Weinberg平衡檢測<1E-10的SNP位點，將過濾后的SNP位點進行關聯分析。（4）富集分析：通過hapmap數據庫進行功能注釋，分別進行GO分析和KEGG分析。

1.3 統計學方法 采用 SPSS 22.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，或中位數（四分位間距）表示，組間差異采用方差分析或秩和檢驗。組間性別比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DILI患者一般資料 DILI患者平均住院11（8~17）d；引起肝功能損害的藥物有：中草藥（雷公藤、決明子、柴胡、何首烏、壯骨關節丸、尿毒清）14例，西藥（別嘌醇、阿托伐他汀、對乙酰氨基酚、抗結核藥、秋水仙堿 ）16例，其中抗結核藥（異煙肼、利福平、吡嗪酰胺 ）6例；DILI患者血清學指標見表1。

表1 DILI患者入院和出院時血清學指標

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 所選取的樣本經Hardy-Weinberg平衡檢測P>0.05，表明樣本具有代表性，所代表的群體符合遺傳平衡。

2.3 數據處理和關聯分析 60個樣本檢測出的SNP經數據過濾后得到SNP 287769個，再經關聯分析后得到有統計學意義的SNP 8352個（見圖1）。等位基因差異最大的SNP位點（P<0.0001）總共有16個，對應有7個基因：CTNNBIP1、LOC105376942、HLA-DQA1、IGF2R、LOC112268039、DNHD1、LACC1，其中第6號染色體上的差異SNP位點比較集中，其所對應的基因為HLA-DQA1和IGF2R（見表2）。

表2 全基因組等位基因關聯分析與肝細胞型DILI有強相關的SNP

圖1 等位基因關聯分析曼哈頓圖

2.4 富集分析 8352個SNP對應的基因總共有591個。繪制GO分析的生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）顯著性最小的前10個注釋基因的條形圖，見圖2。同時繪制KEGG富集分析結果中顯著性最小的前12個通路的氣泡圖，見圖3。最后對16個差異最顯著的SNP進行GO分析，結果發現差異最顯著的基因為HLA-DQA1和IGF2R。見表3，表4。細胞組分分析顯示這兩個基因主要存在于高爾基體、細胞核、細胞內吞小泡、反式高爾基體網、網格蛋白小泡膜上；分子功能分析顯示這兩個基因主要參與多肽抗原連接、胰島素樣生長因子結合、鳥嘌呤核苷酸結合、胞內維甲酸結合和MHC II類受體活性。

表3 差異表達基因生物學過程GO分析結果

表4 差異表達基因細胞組分GO分析結果

圖2 差異表達基因GO富集圖

圖3 差異表達基因KEGG富集圖

3 討論

目前DILI的診斷為排他性的診斷，診斷之前需排除其他肝臟疾病，然后根據可疑藥物接觸史及傳統生物標志物ALT、AST、ALP［8］進行診斷，加上DILI缺乏特異性的生物標志物和典型的臨床表現，因此DILI的診斷難上加難，臨床上經常出現漏診、誤診現象。目前，有1200余種藥物可導致不同程度的肝損傷［9］，國外以抗菌藥所致的DILI最為常見［10］，我國以抗結核藥所致的DILI最為常見［11］，本研究顯示，西藥中導致肝細胞型DILI最常見的為抗結核藥，其次為中草藥。我國DILI的發病率約為92.95/10萬［12］，西方國家DILI的發病率達1~20/1萬［13］。據報道，多數DILI 患者的預后較好，但藥物誘發引起的肝功能衰竭病死率較高，甚至發現3周內接受肝移植者生存率僅42%［14］。因此早診斷、早治療、早預防成為降低DILI病死率的關鍵性因素。

目前，DILI的發病機制尚未明確。有學者認為機體免疫在DILI的發生發展中起關鍵作用，并提出半抗原假說和基因多態性假說。同時，部分研究機構展開了候選基因關聯分析及全基因組關聯分析的深度研究，并發現一些風險遺傳因子，發現某些涉及藥物轉運、細胞應答和免疫反應的基因多態性與個體發生DILI的易感性有關［15-18］。且不同分型的DILI遺傳易感性可能存在差異，有研究發現，HLA-DQB1*0602和HLA-DRB1*1501與阿莫西林克拉維酸引起的膽汁淤積型DILI有關［19］，而HLA-A*3002和HLA-B*1801與阿莫西林克拉維酸引起的肝細胞型DILI有關［20］。本研究針對肝細胞型藥物性肝損傷患者進行GWAS結果顯示，與肝細胞型DILI相關性最顯著的基因是胰島素樣生長因子2受體（IIGF-2R）和人類白細胞抗原-DQA1（HLA-DQA1），其中HLA-DQA1基因的SNP位點rs9272780和IGF2R基因的SNP位點rs4709391與肝細胞型DILI的發病呈強相關性，且差異最顯著的SNP位點主要集中在6號染色體上。

IGF2R基因定位于常染色6q26區域，全長約136kb，含有48個外顯子，屬I型跨膜糖蛋白［21］。近年來研究顯示，IGF2R在體內、體外均可抑制細胞的生長，對于抑制細胞過度增殖和促進凋亡具有重要調節作用［22］。目前研究發現，IGF2R基因多態性與多種腫瘤的發生發展密切相關，如肝癌、胃癌、結直腸癌、肺癌等［23-25］，IGF2R被稱為腫瘤的抑癌基因。且有研究發現IGF2R基因的突變可能抑制機體的免疫功能［26］，而免疫性損傷及細胞凋亡在DILI的發病機制中起重要的作用，本研究對16個差異最顯著的SNP進行GO分析發現，IGF2R基因主要與生長因子、高爾基體有關，因此作者推測，IGF2R基因多態性可能與肝細胞型DILI的易感性有關。

HLA基因位于人體第6號染色體短臂上，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類3個基因區，其中Ⅱ類基因區主要包括HLA-DR、DP、DQ3個亞區，主要參與外源性抗原提呈和免疫應答，因此HLA與機體的免疫調節及免疫應答有著密切的關系。雖然DILI發病機制尚未完全明確，但目前很多研究表明HLA基因突變是導致DILI的一個獨立的危險因素［27］。楊志明等［28］研究發現HLADQA1*0103等位基因可能是慢性丙型肝炎的拮抗基因，而HLA-DQA1*0501等位基因可能會抑制轉氨酶升高，減慢肝功能損害的進程，最終影響疾病的轉歸。且也有研究［29］發現HLA-DQA1基因多態性與慢性乙型病毒性肝炎易感性有關。MENG等［30］研究發現HLADQA1*0102為抗結核藥物所致肝損傷的保護因素。本研究發現HLA-DQA1基因多態性與肝細胞型藥物性肝損傷易感性有關。

藥物性肝損傷是與多基因相關的，是包括環境、遺傳、藥物等多種因素引起的復雜性肝病。IGF-2R和HLA-DQA1基因多態性可能與肝細胞型藥物性肝損傷易感性有關，下一步作者將加大樣本量、針對單一藥物或某一類藥物進行進一步驗證，為DILI的發病機制提供理論依據，以及為篩查DILI的易感人群和診斷DILI提供可行的方法。