肝硬化門靜脈高壓動物模型的實驗對比研究

胡豆豆 任萬雷 仇莎 姜相君

門靜脈高壓癥迄今尚無有效的治療方法，建立適合的門靜脈高壓動物模型對研究門靜脈高壓的發(fā)病機制及其治療意義重大。目前建立門靜脈高壓動物模型的方法有很多，各具優(yōu)缺點。本研究將對四氯化碳(CCl4)化學損傷性以及膽管結扎(BDL)機械梗阻性大鼠門靜脈高壓模型進行研究，分析其在門靜脈高壓形成過程中的特點，為后續(xù)實驗開展提供準確的方法。

材料與方法

一、實驗動物

雄性Wistar大鼠，清潔級，體質(zhì)量200～220 g，飼養(yǎng)溫度 20～25 ℃，相對濕度40%～70%，每日光照12 h。用桿狀飼料喂養(yǎng)，去離子水裝入水瓶供動物自由飲用。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證編號No SCXK(京)2006-2009。實驗動物飼養(yǎng)于青島大學SPF級實驗動物房，許可證號：12-1004。本研究方案經(jīng)青島市市立醫(yī)院倫理委員會審批，符合實驗室動物管理與使用準則。

二、研究方法

(一)CCl4模型建立 將大鼠隨機分為CCl4組(n=6)及對照組(n=6)。CCl4組：腹腔注射40% CCl4(CCl4：橄欖油=比例2∶5 mL)0.2 mL/100 g，每周2次，共注射12周。分別于造模后4周、8周、12周測量門靜脈壓力、取大鼠肝臟、脾臟標本。對照組：按照0.2 mL/100 g劑量給予腹腔注射橄欖油溶液，每周2次，共注射12周。分別于注射后4周、8周、12周測量門靜脈壓力、取肝脾組織標本。

(二)BDL模型建立 將大鼠隨機分為BDL組(n=6)和假手術組(n=6)。BDL組：禁食不禁水12 h，0.2%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為0.1 mL/100 g，沿著腹白線剪開進入腹腔，游離膽總管，分別在上、下游相隔1.5 cm的兩處結扎，并在結扎中間剪斷，分層縫合。分別于造模后4周、8周、12周測量門靜脈壓力、取大鼠肝臟、脾臟標本。假手術組：麻醉后打開腹腔，充分暴露及游離膽總管，不結扎膽總管, 于造模后4周、8周、12周測量門靜脈壓力，取大鼠肝臟、脾臟標本。

三、觀察指標

(一)一般情況 觀察大鼠皮毛色澤、黃疸以及活動情況。

(二)測量大鼠門靜脈壓力 大鼠皮下注射0.2%苯巴比妥鈉麻醉，劑量為0.1 mL/100 g；將大鼠腹部剃毛后固定于鼠板上，沿著腹白線剪開進入腹腔，在腸系膜后靜脈起始部分離出6～8 mm長的腸系膜后靜脈，將周圍組織清除干凈；分離干凈后在血管上段和下段各穿一根手術縫線，用穿線結扎腸系膜后靜脈的最下端，前段扎線用于插管后固定穿刺針；選擇分離干凈的腸系膜后靜脈，用充滿3%肝素生理鹽水的穿刺針從腸系膜后靜脈緩慢插入，一直插到門靜脈主干，用預留的結扎線固定導管，連接BL-420S生物機能系統(tǒng)，測量10 min，取平均值。

(三)肝臟大體標本及病理學分析 將取出的肝臟固定、包埋、切片，進行天狼猩紅染色，后進行脫水、透明、封片，光鏡下觀察。

(四)體質(zhì)量、肝臟濕重和脾臟濕重 在測量門靜脈壓力前先對大鼠進行稱重并記錄體質(zhì)量。門靜脈測壓結束后，分別取出大鼠的肝臟、脾臟，稱重并記錄。

四、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的資料以(均數(shù)±標準差)表示，兩組比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、動物的一般情況

對照組大鼠毛發(fā)柔順有光澤、活動自如、攝食正常。CCl4組大鼠在整個造模過程中食欲減退、皮毛枯槁、活動減少、懶動喜臥。與假手術組相比，BDL組大鼠最突出的特點是皮膚和毛發(fā)黃染，以耳部及尾部最為明顯，且尿色發(fā)黃。

二、門靜脈壓力的變化

正常大鼠門靜脈壓力為 6～7 mmHg，與人的門靜脈壓力值相近。CCl4組，在整個造模過程中，門靜脈壓力呈逐漸升高趨勢，與對照組比，造模4周時門靜脈壓力輕度升高，造模8周、12周時門靜脈壓力則明顯升高且有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表1)，造模12周部分大鼠有腹水、腸系膜側(cè)枝循環(huán)形成等表現(xiàn)。與CCl4組相比較，BDL組門靜脈壓力卻呈現(xiàn)短期迅速升高趨勢。造模4周，大鼠門靜脈壓力明顯升高，高達(16.15±1.61)mmHg。造模8周、12周時門靜脈壓力分別為(16.69±2.10)mmHg、(16.21±3.44)mmHg，與假手術組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表2)。

表1 CCl4組不同階段大鼠各項指標比較結果(均數(shù)±標準差)

表2 BDL組不同階段大鼠各項指標比較結果(均數(shù)±標準差)

三、肝臟大體標本觀察

正常大鼠肝臟分六葉，表面光滑、邊緣銳利、質(zhì)地柔軟、色澤紅潤。CCl4組隨著纖維化程度加重，肝葉變形、邊緣變鈍，肝葉之間粘連，伴脂質(zhì)沉積。造模后期肝臟體積明顯縮小，質(zhì)硬，呈結節(jié)狀。BDL組大鼠肝臟體積增大，肝葉形態(tài)尚存，肝臟表面呈現(xiàn)暗黃色。造模后期肝葉質(zhì)地變硬，邊緣變鈍，表面呈深褐色，甚至黃綠色(圖1)。

四、肝臟濕重和脾臟濕重變化

從圖1可以看出，CCl4組造模初期，主要表現(xiàn)為肝葉變形、粘連。造模12周時，隨著纖維化程度加重，肝臟表面呈顆粒狀，肝臟濕重較對照組明顯增加(P<0.05)。而BDL組，由于膽總管被截斷，肝內(nèi)膽汁淤積、膽管增生，肝葉體積增大更為明顯，造模4周、8周及12周較對照組均明顯增加且有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖A為對照組大鼠肝脾大體圖像；圖B-D分別為CCl4造模4周、8周、12周大鼠肝脾大體圖像；圖E為假手術組大鼠肝脾大體圖像；圖F-H為BDL術后4周、8周、12周大鼠肝脾大體圖像。

CCl4組，門靜脈壓力隨著造模時間逐漸升高，脾臟質(zhì)量亦是逐漸增加的，造模8周、12周時脾臟質(zhì)量逐漸增加，較對照組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而BDL組，造模4周時，脾臟重量較假手術組就有明顯增加，造模8周、12周時與假手術組比較仍有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)。可見，不論在CCl4組還是BDL組，脾臟質(zhì)量與門靜脈壓力升高趨勢是一致的。

五、病理觀察

正常肝小葉結構清晰，門靜脈及中央靜脈周圍有少許被天狼猩紅染色的膠原組織。CCl4組造模4周可見纖細的匯管區(qū)-匯管區(qū)(P-P)、匯管區(qū)-小葉中央(P-C)纖維間隔形成；造模8周時可見纖維間隔進一步分割肝實質(zhì)；造模12周時大鼠肝臟小葉結構紊亂，假小葉形成。BDL組造模4周匯管區(qū)可見大量膽管樣上皮細胞增生，并延伸至小葉內(nèi)；造模8周可見匯管區(qū)擴大，增生的間隔相互連接；造模12周時肝組織滿布增生的膽管，肝實質(zhì)包繞、分割，小葉結構破壞(圖2)。

圖A-C分別為CCl4模型組4周、8周、12周大鼠肝臟病理圖像(天狼猩紅染色)；圖D-F分別為BDL 模型組4周、8周、12周大鼠肝臟病理圖像(天狼猩紅染色)

討 論

門靜脈高壓癥是慢性肝病肝硬化患者死亡的主要原因[1-2]，門靜脈壓力數(shù)值是決定肝纖維化分級、評價預后、指導治療的重要指標[3]。目前對門靜脈高壓癥仍缺乏有效的治療手段，而門靜脈高壓動物模型的建立可對研究門靜脈高壓癥的發(fā)病機制、治療作用等提供重要的實驗載體。常見的門靜脈高壓動物模型有以下幾種[4-5]：CCl4門靜脈高壓模型、BDL門靜脈高壓模型、硫代乙酰胺(TAA)門靜脈高壓模型、二甲基亞硝胺(DMNA)門靜脈高壓模型、血栓栓塞門靜脈高壓模型等。其中，以CCl4門靜脈高壓模型及BDL門靜脈高壓模型在臨床研究中最為常見，但目前關于兩者門靜脈壓力的變化尚缺乏系統(tǒng)的研究。

肝硬化時，肝內(nèi)阻力增大是門靜脈高壓發(fā)生的始發(fā)因素，也是主要因素[6-8]。當CCl4進入體內(nèi)可導致肝細胞變性、壞死[9]，反復給藥導致正常肝細胞結構破壞，增生的纖維組織包繞分割形成假小葉。在CCl4模型中，膠原纖維增生及再生結節(jié)壓迫可使肝內(nèi)阻力逐漸增大，門靜脈壓力緩慢升高。而在BDL組中，由于人為截斷膽總管，使肝內(nèi)膽汁淤積、膽管擴張，壓迫門靜脈。此外，增生的膽管還可直接壓迫肝血竇，共同導致門靜脈高壓的形成[10]。可見BDL模型門靜脈壓力是驟然升高，后期側(cè)支循環(huán)仍無法有效建立，門靜脈高壓一直維持。

脾大不僅僅是門靜脈高壓癥的一個重要臨床表現(xiàn)，還是判斷門靜脈壓力高低的一個重要指標[11]。Berzigotti等[12-13]提出將肝臟彈性值、血小板數(shù)量與脾臟直徑聯(lián)合起來能很好地預測臨床顯著門靜脈高壓癥及食管靜脈曲張的發(fā)生，并且對脾臟直徑的無創(chuàng)性監(jiān)測可以對肝硬化患者進行預后分層。Hayashi等[14]將脾臟大小與血清膽汁酸水平聯(lián)合起來，從而能夠很好地預測門靜脈壓力。從筆者的研究中可以看出，脾臟質(zhì)量與門靜脈壓力變化趨勢是一致的。在CCl4組，脾臟質(zhì)量隨著造模時間逐漸增加。而BDL組，造模4周時脾臟質(zhì)量明顯增加，是假手術組的3倍，這與人類膽汁淤積型肝硬化是不謀而合的。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cirrhosis, PBC)患者在肝硬化之前就已經(jīng)有脾大[15]。此外，對比兩種模型同期脾臟質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)BDL組脾臟質(zhì)量要高于CCl4組。Terayama 等[15]曾對184例PBC患者及41例非膽汁淤積型肝硬化患者脾臟質(zhì)量進行了比較，PBC患者脾臟質(zhì)量為(450±224)g，要明顯重于非膽汁淤積型肝硬化患者，這與筆者的研究結果是一致的。

本研究的意義是對比分析了CCl4模型以及BDL模型在門靜脈高壓形成過程中的特點，使人們對不同原因肝硬化門靜脈壓力的變化有更深入、更具體的認識。同時也對兩種動物模型進行了系統(tǒng)的分析，為臨床研究中實驗模型的選擇提供理論依據(jù)。本文的研究并不是終點，以后筆者將圍繞現(xiàn)象背后的機制展開研究，知其然更需知其所以然。