慢性HBV感染相關性肝癌發生的突變基因研究

何倩玉 李俊峰 毛小榮

一、前體蛋白

(一) preS1 慢性HBV感染是肝細胞癌(HCC)發生的主要原因。不同的preS/S突變體誘導不同的腫瘤發生機制，如轉錄因子的反激活和免疫炎癥反應，從而導致HCC的發生。研究發現HBV病毒可刺激腫瘤干細胞(CSCs)相關標記(CD133、CD117和CD90)和CSCs相關基因(Klf4、Sox2、Nanog、c-Myc和Oct4)的產生，并促進人肝癌細胞CSCs的自我更新。HBV介導的CSCs生成需要HBV的PreS1蛋白。PreS1可激活正常肝細胞來源的細胞系(L02)和人肝癌細胞系(HepG2和Huh-7)中CD133、CD117和CD90的表達，促進L02細胞更新，提高L02細胞和HepG2細胞誘導腫瘤的能力[1]。為了能更好地研究有關HCC肝臟疾病的進展，研究者們建立了一個可以表達帶有W4P基因突變的完整HBV基因組的轉基因小鼠模型。結果顯示，攜帶W4P基因的雄鼠肝腫大更明顯，肝組織顆粒明顯增多，肝臟和血清HBsAg升高，血清ALT和IL-6也升高。表明preS1中的W4P突變基因可能導致男性HBV病毒復制增加和IL-6介導的炎癥增強，從而導致個人對HCC易感性存在性別差異[2]。另外，Pre-S1 A2962G/C2964A和Pre-S2 C105T突變體導致HBV cccDNA水平顯著升高，而A2962G/C2964A突變體與AFP水平升高相關[3]。還有研究發現，rtF221Y和sR122K與HBV相關HCC復發有關。特別是rtF221Y可以作為預測HCC預后的病毒標志物。為了降低HBV DNA的復制，且預防耐藥，有必要及時、慎重地選擇核苷(酸)類似物(NAs)治療。這有助于降低HBV相關HCC患者的復發率和提高術后生存率[4]。因此，PreS1作為一種新的癌蛋白，在HCC發展過程中發揮關鍵作用，這將有助于揭示HBV相關HCC的病毒學特征，實施更加個性化的臨床診療，并改善疾病預后。

(二)preS2 最近一項研究表明，HBsAg大表面蛋白(LHBs)通過誘導肝細胞DNA損傷和PLK1介導的G2/M檢查點失效，誘導細胞分裂失敗，進而導致非整倍體形成，從而促進HCC的發展。LHBs誘導的細胞分裂失敗可能是HCC發展的啟動因素[5]。與HBsAg不同的是，PreS2中的大形態表面蛋白(LHBS)，其主要表達于HBV誘導的HCC腫瘤區域，提示其在腫瘤進展中發揮獨特作用，血清中preS2突變體的相對水平于腫瘤分期是獨立因素，是原發性肝癌切除術后再次復發的重要高危標志物[6]。人們還發現HBsAg的過度表達，包括大(LHBs)、中(MHBs)和小(SHBs)表面蛋白促進了HCC細胞的增殖和腫瘤形成，同時敲除HCC細胞中的HBsAg可降低IL-6的生成，抑制信號轉換器和轉錄激活因子3 (STAT3)信號傳導，IL-6-STAT3通路可能與HBsAg介導的HBV相關性HCC的惡性程度相關[7]。甲胎蛋白(AFP)和Glypican 3 (GPC3)在HCC中均為癌基因并被重新激活。實驗中，在preS2陽性的HCC標本中AFP及GPC3水平顯著高于preS2陰性的HCC標本，而白蛋白水平無明顯差異。說明preS2蛋白的表達與HCC標志物AFP和GPC3密切相關[8]。HBV轉錄激活的FOXP3基因，編碼了preS2癌蛋白，進而發生HCC；另外，ATAD2可能在HCC發生過程中發揮重要作用，并可能導致腫瘤的惡化。臨床上，ATAD2的檢測可作為肝臟活檢組織鑒別病變性質的有價值的標志物[9-10]。

二、HBV x基因(HBx) 特定基因的基因突變是致癌和肝細胞癌進展的關鍵因素。然而，導致HCC發生、發展和生存預后的基因尚不清楚。大多數HCC患者的HBV整合于HBx區域，TERT啟動子、TP53、CTNNB1、HBV整合等基因的改變與HCC的發展密切相關，TERT啟動子的突變與不良預后相關[11]。研究發現，HCC患者中LINC00152基因的表達明顯高于癌旁非腫瘤組織，且與腫瘤大小、HBsAg及腫瘤數量呈正相關。體外實驗中，在Huh-7和SM7721細胞中，HBx過表達后LINC00152基因上調，HBx沉默后表達下調。表明HBx增強了LINC00152的表達，抑制LINC00152基因點可以作為肝癌的治療靶點[12]。HBV x基因區域的T1753V突變、PC區域的G1896A突變以及前體蛋白的協同作用，可顯著增加C基因型CHB患者HCC的發生[13]。蛋白磷酸酶2A (PP2A)是一種由36 kD催化組成的三聚體蛋白質磷酸酶亞基(PP2Ac)。PP2Ac的高表達與血清HBsAg及HBeAg、肝硬化、肝細胞癌中至差的分化程度、疾病晚期、肝內轉移和早期復發相關。實驗發現PP2Ac與HBx可直接相互作用。PP2Ac過表達可促進HCC細胞增殖、集落形成和腫瘤發生。PP2Ac的上調對HCC患者的總預后生存期有較差的影響，并可增強病毒的侵襲性，PP2Ac可能是HCC潛在的治療靶點[14]。在HBV相關HCC組織和細胞中可檢測到MiR-520e和EPH受體A2 (EphA2)，MiR-520e上調，EphA2則下調。實驗表明在HBV感染的HCC中，MiR-520e的過表達通過抑制EphA2，阻斷p38MAPK和ERK1/2信號通路，從而減少HBV復制，抑制腫瘤細胞生長[15]。

功能性LncRNA基因參與多種癌癥的發生。關于HBV相關性HCC的遺傳易感性，已經進行了一些全基因組關聯研究(GWAS)。多種單核苷酸多態性(SNPs)，如STAT4位點的rs7574865，HLA-DQ位點的rs9275319，8p12位點的rs12682266、rs7821974、rs2275959、rs1573266等，已被發現與HCC的發生有關[16]。研究選取的SNP中，rs12427129和rs3816153、rs2723175和rs2708973，可能在對HCC的易感性上發揮重要作用；rs2723176、rs2723175、rs2723186、rs364030、rs28947200、rs4392270 等與HBV的清除有相關性。尤其是rs4849133與HBV攜帶者和HBV相關性肝病進展相關[17]。

三、HBV病毒

牛磺膽酸鈉的協同轉運由SLC10A1編碼的多肽(NTCP)是近年來研究的熱點，認為SLC10A1 (NTCP) S267F變異與肝硬化、HCC風險降低以及抗HBV感染有獨立相關性。研究中SLC10A1 (NTCP) S267F變異在排除性別、年齡、血清ALT和HBV DNA水平等重要危險因素后，與肝硬化、肝硬化HCC和非肝硬化HCC具有顯著且獨立的相關性[18]。

DNA雙鏈斷裂(DSBs)是細胞失活最嚴重的機制之一，因為它們可以阻斷細胞周期的進展。DSBs可以發生在DNA復制過程中，也可以暴露于氧化應激、化療或輻射之下。由于基因組不穩定和染色體易位，DSBs的積累可導致細胞凋亡。DSBs的修復經過兩種細胞途徑，即非同源黏性末端連接(NHEJ)和同源基因重組(HR)。腫瘤表達的蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs),與肝癌患者的腫瘤進展、HBsAg載量和術后預后相關[19]。

典型的核因子jB (NF-jB)信號通路在HCC發生、發展中的作用取決于肝損傷模式，在HBV驅動的肝癌發生中，肝細胞中的NF-jB通過增強內質網應激反應而發揮重要的腫瘤抑制因子的作用[20]。

miRNAs 是一類約含 20～25 個核苷酸的非編碼RNA，它可以通過與靶基因非編碼區結合，從而影響基因的編碼和穩定性。研究發現HBV感染合并肝癌患者肝臟中Let-7a水平明顯降低，與肝內preS2 mRNA水平呈負相關。體內外研究表明，HBV miRNA抑制let-7a靶點，可增強HCC細胞集落形成和腫瘤生長，這為miRNA的致癌潛力提供了證據[21]。Let-7a miRNA可在各種癌癥中顯示下調。上調let-7a可減少HBV復制，并可預防HCC的發展，這一點可能是一種有效的治療HBV感染的方法[22]。除此之外，血清 miR-375 和 miR-146a 在診斷上的敏感性和特異性均優于 CA19-9 和 AFP, miR-375 和miR-146a 可作為原發性肝癌,尤其是有HBV感染史患者原發性肝癌的診斷標志物[23]。

四、宿主免疫功能

HBsAg-toll樣受體2(TLR2)通路對HBV相關HCC細胞生長和侵襲的影響，與HepG2細胞相比，HepG2.2.15細胞中TLR2的mRNA和蛋白水平明顯升高。HBsAg增加了促炎細胞因子的產生和HepG2.2.15細胞的侵襲，而這一過程被TLR2所抑制。JS-K是一種釋放一氧化氮的重氮庚二酸鹽，對多種腫瘤有效，可抑制HepG2.2.15細胞生長，抑制細胞集落形成和遷移，阻滯細胞在G2期聚集，其作用機制不僅與抑制HBsAg和HBeAg分泌有關，還與誘導DNA損傷和凋亡有關。所以JS-K是一種很有前景的治療HCC的候選藥物[24-25]。另一項研究表明，高表達的HBsAg增強了與膜聯蛋白II的相互作用。然而,膜聯蛋白II不是跨膜蛋白。因此,通過TLR4 / 88 (MyD88) /骨髓分化因素NF-κB軸實現，某些方面HBsAg/GDPI復合物的機制激活了NF -κB通路。我們發現通過TLR4 / MyD88 /IκBαaxis的通路，HBsAg /β2 GDPI才可激活NF -κB信號通路，在HCC形成中發揮著關鍵作用在[26]。上述研究表明，TLR信號通路與慢性HBV感染期間的炎癥和腫瘤進展有關，并也可通過BMI1和DKK1促進HBV相關HCC的進展[27]。

五、其他突變基因及通路

最近的證據表明，TIP30可能參與了上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的調控。細胞實驗顯示，HBV可能通過下調TIP30的表達來促進HCC的進展。TIP30在HCC中的下調可能是由HBV感染引起的，是影響HCC患者預后的獨立不良因素[28]。研究表明，CASP8-652 6N ins/del多態性可能是中國漢族人群HBV相關HCC的風險和預后生物標志物，與HCC的發生、發展和預后生存中起著積極的作用[29]。有報道稱，HBV rtA181T/sW172*突變體的出現可導致HBsAg顯性分泌缺陷，增加HCC發生的風險。sW172*突變編碼可能增加HBV相關性腫瘤發生的可能性，其機制可能與TGF- TGF /Smad信號通路中TGFBI表達下調有關。然而HBV突變體編碼截斷型HBsAg的確切生物學特性尚不清楚，截斷型HBsAg增加HBV致瘤的確切機制尚需更多研究揭示[30]。

泛素-細胞色素c還原酶鉸鏈蛋白(UQCRH)由線粒體呼吸的細胞色素BC1復合物組成。UQCRH在腫瘤較大、分化較差的肝癌細胞中高度表達，或存在侵襲血管。UQCRH過表達與HCC患者預后不良相關。此外，在以AFP升高為主的高危分組的患者中，UQCRH無過表達可能是臨床治療的參考指標[31]。

肝癌細胞中鋅指抗病毒蛋白(ZAP)，ZAP的表達與凋亡信號通路相關。在HCC中ZAP低表達較為常見，與HCC進展及預后較差相關，在HCC的發生中起重要作用。還需要更多、更大樣本量的臨床研究來闡明HCC和ZAP表達之間的相關性，將ZAP確定為腫瘤抑制基因，并將其作為治療HCC的新靶點[32]。

HBV與肝癌的發生有密切的聯系，隨著分子生物學及細胞生物學等先進技術的應用，在HCC發病機制方面的研究取得了一定進展,但缺乏突破性。以上研究對于進一步理解HBV的腫瘤發生機制非常重要，這些結果對于理解肝癌發生、診斷和預測HCC患者預后的潛在機制非常有用，并將為預防HBV相關肝癌的發生及其進展提供新的策略。