乙型肝炎病毒pgRNA與不同血清學指標之間的相關性分析

張明躍 曹明 王凱翔 陳浩

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一個嚴重的公共衛生問題。在2017年，Lok[1]發表在《Journal of Hepatology》中的一篇review中指出，在接受核苷(酸)類藥物(NA)治療的患者中，當 HBV DNA 檢測不到時，可以檢測血清中的 HBV-pgRNA 用來推斷 cccDNA 是否進行轉錄，推測血清HBV-pgRNA可作為 cccDNA 轉錄活性的有效替代標志物。本文通過使用北京熱景生物技術股份有限公司生產的HBV-pgRNA測定試劑盒對來源于保定傳染病醫院的臨床血清樣本中的RNA進行測試，從而分析該指標與其他血清學指標之間的相關性。

資料與方法

一、一般材料

(一)樣本來源 樣本來源于保定傳染病醫院，共計332例，已知HBV DNA背景陽性167例，陰性165例；HBV-LP背景陽性191例，陰性141例；HBsAg背景陽性289例，陰性43例；HBsAb背景陽性67例，陰性265例；HBeAg背景陽性95例，陰性237例；HBeAb背景陽性189例，陰性143例；HBcAb背景陽性325例，陰性7例。在如上慢性乙型肝炎臨床樣本中男性202例，女性130例；年齡2～91歲，平均年齡44.5歲。

(二)試劑以及耗材 ①HBV-pgRNA測定試劑盒：北京熱景生物技術股份有限公司；②磁力架：蘇州海貍生物技術有限公司。

(三)主要設備 ①ABI 7500T ImePCR：Applied Biosystems；②振蕩混勻器：大龍興創實驗儀器(北京)股份公司；③微型離心機：杭州米歐儀器有限公司。

二、研究方法

(一)檢測方法 HBV-pgRNA采用PCR-熒光探針法，測定試劑盒以HBV-pgRNA拷貝數 ≥300 copies/mL作為HBV-pgRNA陽性標準，且所有的操作嚴格按照試劑說明書的要求對標本進行檢測 。

(二) 統計學分析 使用GraphPad軟件對HBV-DNA、HBV-pgRNA、HBV-LP三者之間的相關性進行分析；在HBeAg陽性和陰性患者中，對HBV-DNA、HBV-pgRNA以及HBV-LP的平均水平進行分析，以及對HBV-pgRNA與HBsAg和HBcAb的相關性進行分析。

結 果

一、HBV-DNA、HBV-pgRNA、HBV-LP三者之間的相關性分析

通過GraphPad相關性統計學分析證實，在332例乙型肝炎病毒感染患者樣本的測試中，血清HBV-pgRNA與HBV-DNA均具有較強的相關性，且呈正相關；而血清HBV-DNA與HBV-LP以及血清HBV-pgRNA與HBV-LP具有相對較弱的相關性。

二、HBeAg陽性和陰性患者中，HBV-DNA、HBV-pgRNA以及HBV-LP的平均水平

對332例乙型肝炎病毒感染患者樣本的檢測數據進行分析，按照HBeAg狀態進行分析發現，當乙型肝炎病毒感染患者的HBeAg呈陽性時，其血清HBV-DNA以及HBV-pgRNA的平均含量均處于較高水平，而血清HBV-LP的含量相對較低，三者的檢出率接近；當乙型肝炎病毒感染患者的HBeAg呈陰性時，HBV-pgRNA的平均含量與HBV-DNA的平均含量接近，但其檢出率遠高于HBV-DNA的檢出率。

圖1 HBV-DNA與HBV-pgRNA的相關性

圖2 HBV-DNA與HBV-LP的相關性

圖3 HBV-pgRNA與HBV-LP的相關性

三、HBV-pgRNA與HBsAg的相關性分析

對101例乙型肝炎病毒感染患者樣本的檢測數據進行分析，按照HBeAg狀態進行分析發現，血清HBV-pgRNA在HBeAg陽性的HBV感染者中與HBsAg具有相關性，但在HBeAg陰性HBV感染者中與HBsAg的相關性較弱。

四、HBV-pgRNA與HBcAb的相關性分析

通過GraphPad相關性分析證實，血清HBcAb與HBV-pgRNA在157例乙型肝炎病毒感染患者的測試中相關性較弱。

圖4 HBV-pgRNA與HBcAb的相關性

討 論

對于血清中檢測出HBV-pgRNA的情況，Kock 1996年發表在《Hepatology》上的文獻中就指出，在慢性HBV感染的血液中檢測到了RNA[2]。2016年，Jansen[3]認為在接受抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者血清中發現HBV-pgRNA水平與患者病毒學應答和預后有關。2018年11月，美國食品藥品管理局(FDA)上公布的《Chronic Hepatitis B Virus Infection Developing Drugs for Treatment》中指出，HBV-pgRNA可以作為早期臨床試驗中研究一些探索性的療效終點的指標之一[4]。乙型肝炎臨床診斷及檢測新型試劑課題組在研究中證實，血清中的HBV-pgRNA為前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)，其來源為核衣殼包裹的pgRNA 在未啟動逆轉錄步驟的情況下，直接獲得包膜并從感染的肝細胞中釋放出來。因該病毒顆粒所含的核酸為pgRNA，故稱之為“HBV-pgRNA 病毒樣顆粒”[5]。與HBsAg不同的是，由于HBV基因組全長為3.2 kb，3.5 kb長的HBV pgRNA只能由cccDNA轉錄產生，而不可能來自整合的HBV基因片段，所以理論上血清中HBV-pgRNA病毒樣顆粒的檢測更能反映肝細胞內cccDNA的狀態[6](包括cccDNA存在與否及其轉錄活性)。同時，血清 HBV-pgRNA 僅來源于 cccDNA 且不直接被核苷(酸)類藥物影響，被認為是一個理想的反映肝組織 cccDNA 的活性血清替代指標，這在魯鳳民[7]教授團隊的最新研究成果中得到了證實。另外，魯教授在研究成果中也認為檢測血清中 pgRNA 病毒顆粒可以反映出患者肝細胞內 cccDNA的轉錄活性，并且在用NA治療的病例中，血清 HBV-pgRNA 持續低于檢測下限可用作預測標記物，以指導NA治療的安全停藥[8]。

在本研究的332例樣本中，HBV-DNA與HBV-pgRNA具有較強的相關性，且呈正相關，血清HBcAb與HBV-pgRNA、HBV-DNA與HBV-LP以及HBV-pgRNA與HBV-LP具有相對較弱的相關性，在HBeAg陽性的乙肝患者中，HBV-DNA與HBV-pgRNA在患者體內均處于較高的水平，而在HBeAg陰性的乙肝患者中，HBV-pgRNA的含量要高于HBV-DNA的含量。

因此，定量檢測血清HBV-pgRNA的水平可作為其他血清學檢測項目的輔助檢測手段，指導治療乙型肝炎病毒感染的安全停藥點。