原發性肝癌患者LncRNA-MEG3表達與臨床病理特征及預后的關系

侯亞萍 張小晶 李婷

原發性肝癌是消化系統較常見的惡性腫瘤之一，該疾病在早期缺乏明顯癥狀，極易被忽視，發現時患者多已處于中晚期，具有發病率高、預后較差、死亡率高等特點[1-2]。目前，臨床上治療原發性肝癌的方法多樣，但患者預后較差。因此，探討該疾病的發病機制對患者的治療及預后評估具有重要的意義。長鏈非編碼RNA人母系表達基因(Long non-coding RNA maternally expressed gene3，LncRNA-MEG3)是一種定位于人類染色體14q32.3中的印記基因[3-4]，研究表明LncRNA-MEG3高表達可抑制肝癌細胞增殖，促進細胞凋亡[5]。本研究擬通過檢測原發性肝癌患者血清LncRNA-MEG3的表達情況，并探究其表達水平與原發性肝癌患者預后的關系，以期為臨床治療原發性肝癌提供有價值的參考依據，現報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年4月至2016年11月西京醫院收治的原發性肝癌患者68例為原發性肝癌組，其中男39例，女29例，年齡38～65歲，平均年齡(51.34±4.73)歲。同期選取在本院進行常規體檢的健康人群70例為對照組，其中男38例，女32例，年齡36～65歲，平均年齡(50.96±5.02)歲。按照國際抗癌聯盟及美國癌癥聯合會(UICC/AJCC)制定的原發性肝癌臨床分期標準進行分期[6]：Ⅰ-Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期38例。原發性肝癌組及對照組之間年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

原發性肝癌組納入標準：①符合原發性肝癌的相關診斷標準[7]；②患者及家屬選擇在本院接受治療者；③臨床資料完整者。排除標準：①出現合并性腦病者；②同時患有其他惡性腫瘤者；③臨床隨訪資料不全者。

該研究經本院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情并簽署同意書，且符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

二、主要試劑與儀器

離心機(貨號：4-TK)，購自湖南恒諾儀器設備有限公司；RNA提取試劑盒(貨號：DP419)，購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒(貨號：KL266)，購自上海康朗生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(貨號：V115896)，購于美國應用生物系統公司；LncRNA-MEG3及GAPDH引物，由北京寶日醫生物技術有限公司合成；本研究中其他化學藥品均購自北京甘棠飛華生物科技有限公司。

三、研究方法

于清晨抽取所有受試者空腹狀況下的靜脈血5 mL，離心分層后收集上層血清，置于-20℃冰箱中保存待測。

采用實時熒光定量PCR法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測所有研究對象血清LncRNA-MEG3的表達水平。具體步驟為：取待測血清，使用RNA提取試劑盒并嚴格按照說明書步驟進行操作，提取總RNA，然后經逆轉錄得到cDNA。以逆轉錄合成cDNA為模板，進行qRT-PCR檢測。PCR反應條件如下：95℃，180 s；95℃，15 s；60℃，75 s；95℃，15 s；共38個循環。血清LncRNA-MEG3及內參GAPDH的上下游引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法計算血清LncRNA-MEG3相對表達量。每個反應重復3次取平均值。

表1 引物序列

四、隨訪

對本研究中涉及的所有患者治療出院后進行門診復查或電話隨訪，并根據相關標準對患者預后進行評估，隨訪時間為3年，末次隨訪時間為2019年11月30日，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止期，并做好記錄，本次隨訪的中位隨訪時間為1.42年，且本研究中未出現失訪情況。

五、統計學分析

結 果

一、兩組血清LncRNA-MEG3表達水平比較

原發性肝癌組(0.86±0.25)血清LncRNA-MEG3表達水平顯著低于對照組(1.24±0.37)(t=0.705，P<0.05)。

二、LncRNA-MEG3表達水平與原發性肝癌臨床病理特征的關系

以血清LncRNA-MEG3表達水平的平均值(0.93)將原發性肝癌患者分為兩組，高于平均值為高表達組，低于平均值為低表達組。原發性肝癌患者血清LncRNA-MEG3表達與原發性肝癌臨床分期、分化程度及肝硬化密切相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑無明顯相關性(P>0.05)。詳見表2。

表2 LncRNA-MEG3表達與原發性肝癌臨床病理特征之間的關系[n(%)]

三、LncRNA-MEG3表達與患者預后的關系

對本次68例原發性肝癌患者隨訪時間3年，生存30例，總生存率44.1%。繪制原發性肝癌患者治療后1～36個月LncRNA-MEG3高、低表達組的生存曲線。LncRNA-MEG3高表達組治療后3年總生存率為58.3%(21/36)，95%CI：28.731～33.474；LncRNA-MEG3低表達組治療后3年總生存率為28.1%(9/32)，95%CI：24.088～30.025。兩者比較Log-rank值為6.146，P值為0.013，見圖1。

圖1 原發性肝癌患者LncRNA-MEG3表達3年生存曲線

四、影響腦膜瘤患者預后的因素分析

單因素分析顯示，LncRNA-MEG3低表達、臨床分期、分化程度及肝硬化均是影響原發性肝癌患者預后的危險因素。多因素分析顯示，LncRNA-MEG3低表達和臨床分期是影響原發性肝癌患者預后的獨立危險因素(HR=2.500，95%CI為1.624～3.849；HR=2.024，95%CI為1.307～3.135，P均<0.05)。詳見表3。

表3 影響原發性肝癌患者預后的因素分析

討 論

原發性肝癌是消化系統常見惡性腫瘤，發病較隱匿，當患者肝區出現明顯疼痛、腹水、黃疸等癥狀去醫院就診時，已處于中晚期，雖進行及時有效治療，但患者的預后仍較差[8-9]。流行病學顯示，原發性肝癌死亡率居各種癌癥第二位，且發病率呈明顯上升趨勢，威脅生命健康安全，并帶來沉重經濟負擔[10]。因此，探究與原發性肝癌預后相關的影響因子，對改善原發性肝癌預后有一定意義。

長鏈非編碼RNAs(long non-coding RNA, LncRNAs)是一類自身缺乏編碼蛋白能力的RNA分子，近年來發現LncRNA可參與機體多種生物學過程，并在多種癌癥及各種疾病的發生和發展中發揮重要作用[11-12]。有研究發現LncRNA在原發性肝癌的發生及發展中起重要作用。方長英等[13]研究發現，長鏈非編碼RNA外泌體復合物7(LncRNA EXOC7)在肝癌組織中高表達，且其表達水平與原發性肝癌患者的預后密切相關。LncRNA-MEG3是一種單拷貝印記基因，也是近年來新發現的一種具有腫瘤抑制功能的LncRNA[14-15]。研究顯示，LncRNA-MEG3與多種疾病的發生發展有關。孫旭等[16]研究發現，LncRNA-MEG3在鼻咽癌組織和細胞系中低表達，且其表達水平與miR-7-5P水平密切相關。陳曉雷等[17]研究發現，雷公藤紅素可通過上調LncRNA-MEG3的表達來抑制肝癌HepG2細胞增殖，進而促進細胞凋亡。然而有關LncRNA-MEG3對原發性肝癌預后影響的研究甚少。本研究結果顯示，原發性肝癌組血清LncRNA-MEG3表達水平顯著低于對照組，提示LncRNA-MEG3可能參與原發性肝癌的發生發展。進一步研究發現，原發性肝癌患者血清LncRNA-MEG3表達與臨床分期、分化程度及肝硬化密切相關。生存曲線分析表明，LncRNA-MEG3低表達組治療后3年總生存率低于LncRNA-MEG3高表達組，提示LncRNA-MEG3表達水平可為原發性肝癌患者預后的預測提供參考。單因素分析顯示，LncRNA-MEG3低表達、臨床分期、分化程度及肝硬化均是影響原發性肝癌患者預后的危險因素。多因素分析顯示，LncRNA-MEG3低表達和臨床分期是影響原發性肝癌患者預后的獨立危險因素，提示提高LncRNA-MEG3表達可能有助于緩解原發性肝癌病情的發展，有利于患者預后。

綜上所述，LncRNA-MEG3在原發性肝癌患者血清中的表達水平明顯降低，且與患者臨床分期、分化程度及肝硬化有關，其表達水平與患者預后密切相關，提示LncRNA-MEG3或許可作為原發性肝癌病情評估及不良預后預測的潛在生物學指標，但其具體的作用機制還有待深入研究。