CYP2C19基因多態性與不同年齡層大動脈粥樣硬化型小卒中患者口服氯吡格雷治療后臨床預后的相關性研究

秦義人，王達鵬，趙紅如，方琪

氯吡格雷是一種在冠心病和缺血性腦卒中發病過程中發揮重要作用的前體藥物，其必須經人體中肝細胞色素P450（CYP）酶同工酶CYP2C19代謝生成活性產物，不可逆地阻斷P2Y12受體，從而發揮抗血小板的生物學效應［1］。研究表明CYP2C19基因多態性（尤其是CYP2C19*2 和CYP2C19*3）在冠心病患者中與臨床預后高度相關［2］。然而，CYP2C19基因多態性與缺血性腦血管病的相關性目前仍存在爭議，尤其是在大動脈粥樣硬化型腦卒中或小卒中人群中缺乏相關研究。以往研究認為，腦卒中患者的CYP2C19酶活性減少與卒中不良臨床預后相關，亦有研究并未發現這種相關性［3-4］，產生這種差異的機制解釋為年齡可能在其中扮演了重要角色。既往研究表明，CYP酶活性在實驗動物和人體中均呈年齡依賴性降低，從而影響其藥物代謝效率［5-6］。因此，本研究通過分析不同年齡層大動脈粥樣硬化型小卒中患者CYP2C19基因多態性與臨床預后的相關性，為優化特定類型患者的二級預防策略提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年4月—2018年4月在蘇州大學附屬第一醫院神經內科住院治療的大動脈粥樣硬化型小卒中患者479例作為研究對象，年齡≤60歲169例，年齡＞60歲310例。大動脈粥樣硬化型卒中的診斷標準符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中缺血性腦卒中標準［7］，小卒中定義為美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評分≤3分［8］。納入標準：（1）48 h內首次發生的急性缺血性腦卒中；（2）年齡28～90歲；（3）入組時僅同意使用氯吡格雷單抗血小板而非早期雙抗血小板治療方案。排除標準：（1）在入院前1個月、住院和隨訪期間接受了溶栓、抗凝、其他抗血小板藥物治療方案；（2）對氯吡格雷過敏；（3）近6個月內有顱內出血史；（4）診斷為血小板減少癥、惡性腫瘤、嚴重肝腎疾病、心功能不全；（5）有卒中或短暫性腦缺血發作病史；（6）住院和隨訪期間行頸動脈內膜切除手術或頸動脈支架成形術，中途改用其他抗血小板藥物或停服氯吡格雷的患者。本研究經蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準〔（2020）倫研批第061號〕。患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 樣本量計算 根據假定的不良預后率使用PASS 15.0統計軟件進行樣本量估算；根據以往中國人群中的報道，CYP2C19 功能變異型（loss of function，LOF）等位基因（*2、*3）攜帶者和非攜帶者腦卒中不良預后發生率分別為24%和12%，而CYP2C19 LOF等位基因（*2、*3）攜帶和非攜帶者的比例分別為60%和40%［9-10］，計算得出需入組415例患者才能滿足雙側檢驗、顯著性為0.05、把握度90%的統計要求。

1.3 方法

1.3.1 治療及資料收集 患者均接受氯吡格雷口服治療75 mg/次、1次/d，為期1年。住院期間收集患者的基線資料，包括年齡、NIHSS評分、血糖水平、高密度脂蛋白（HDL）水平、低密度脂蛋白（LDL）水平、總膽固醇（TC）水平、三酰甘油（TG）水平、白細胞計數、糖尿病史、高血壓史、CYP2C19 LOF等位基因、吸煙情況（連續或累積吸煙半年以上，每日超過1支，且仍然吸煙）、飲酒情況（男性平均每日大于4個標準單位，女性大于3個標準單位）、性別。患者在入院和出院時均接受2次常規心電圖或Holter檢查來排除心源性栓塞的可能。基因檢測的血樣均在患者入院當天采集，收集在EDTA管內，DNA提取使用商業化萃取試劑盒。根據CYP2C19 LOF等位基因攜帶狀態將患者分為攜帶組和非攜帶組。由于樣本量偏小，本研究中未將患者分為快代謝型、中間代謝型、慢代謝型。

1.3.2 隨訪 研究隨訪開始時間為2015年7月，最終截止時間為2019年5月。隨訪方法：通過門診、電話隨訪等方式在患者出院后3個月和1年時進行隨訪，記錄患者服藥情況、出現缺血性腦卒中復發（包括短暫性腦缺血發作）和長期功能預后及其發生時間。在隨訪3個月和1年后，由專業的神經科醫生通過隨訪記錄每個患者的卒中復發情況，采用改良Rankin 評分量表（mRS）對患者的神經功能缺損及預后進行判定［11］：完全無癥狀者為0分；有癥狀，但無明顯功能障礙，能完成所有日常職責和活動者1分；輕度殘疾，不能完成病前所有活動，但不需要幫助，能自理者2分；中度殘疾，要求部分幫助，但行走不需要幫助者3分；重度殘疾，不能獨立行走，無他人幫助不能滿足自身需要者4分；嚴重殘疾，臥床、失禁、需要持續護理及關注者5分；死亡者6分。mRS≤2分為臨床預后良好（預后良好組），mRS＞2分為臨床預后不良（預后不良組）。

1.4 統計學方法 使用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；CYP2C19 LOF等位基因攜帶和臨床預后的相關性與年齡間的交互效應采用Breslow-Day檢驗和Tarone's檢驗；采用二元Logistic回歸法分析交互效應大小；采用多因素Logistic回歸分析探討臨床預后及復發/死亡的影響因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同年齡段不同預后患者基線資料比較 年齡≤60歲患者：預后良好組與預后不良組NIHSS評分、血糖水平、LDL水平、白細胞計數、糖尿病比例、高血壓比例、CYP2C19 LOF等位基因、吸煙比例比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組年齡、HDL水平、TC水平、TG水平、飲酒比例、性別比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。年齡＞60歲患者：預后良好組與預后不良組血糖水平、HDL水平、LDL水平、TG水平、糖尿病比例、高血壓比例、性別比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組年齡、NIHSS評分、TC水平、白細胞計數、CYP2C19 LOF等位基因、吸煙比例、飲酒比例比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 年齡≤60歲的不同預后患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data of patients aged ≤ 60 years with good and poor outcome

表2 年齡＞60歲的不同預后患者基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data of patients aged ＞60 years with good and poor outcome

2.2 不同年齡段不同CYP2C19 基因型患者基線資料的比較 年齡≤60歲和＞60歲患者中，不同CYP2C19基因型患者年齡、NIHSS評分、血糖水平、LDL水平、HDL水平、TC水平、TG水平、白細胞計數、糖尿病比例、高血壓比例、吸煙比例、飲酒比例、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3～4。

表3 年齡≤60歲的不同CYP2C19 LOF等位基因攜帶患者基線資料比較Table 3 Comparison of baseline data of CYP2C19 LOF allele carriers and non-carriers aged ≤ 60 years

表4 年齡＞60歲的不同CYP2C19 LOF等位基因攜帶患者基線資料比較Table 4 Comparison of baseline data of CYP2C19 LOF allele carriers and non-carriers aged ＞ 60 years

2.3 CYP2C19 LOF等位基因攜帶與年齡間的交互效應Breslow-Day檢驗：CYP2C19 LOF等位基因攜帶和臨床預后的相關性與年齡間存在交互效應（χ2=6.352，P=0.012），Tarone's檢驗：CYP2C19 LOF等位基因攜帶和臨床預后的相關性與年齡間存在交互效應（χ2=6.351，P=0.012）。使用二元Logistic回歸法分析交互效應大小，以是否出現預后不良（賦值：無=0，有=1）為因變量，以CYP2C19 LOF等位基因攜帶情況（賦值：非攜帶=0，攜帶=1）、年齡（賦值：＞60歲=0，≤60歲=1）為自變量，以CYP2C19 LOF等位基因×年齡分層為交互項，分析顯示，交互效應的大小比較，差異有統計學意義〔P=0.013，OR=3.63，95%CI（1.31，10.07）〕， 見表5。此外，不同年齡層患者CYP2C19 LOF等位基因與卒中后3個月卒中復發/死亡相關性差異并無異質性，見表6。而在所有研究患者中，CYP2C19 LOF等位基因攜帶患者3個月卒中復發/死亡比例為9.7%，與非攜帶患者的比例3.9%相比，差異有統計學意義（χ2=5.151，P=0.023）。

表5 不同年齡層的同質性檢驗和CYP2C19 LOF等位基因攜帶與年齡的交互效應分析Table 5 Test of homogeneity of the interaction effect between CYP2C19 LOF allele carriage and age in different age groups

表6 不同年齡層CYP2C19 LOF基因攜帶與卒中復發/死亡的相關性分析〔n（%）〕Table 6 Correlation analysis of CYP2C19 LOF gene carriage and stroke recurrence/death in different agegroups

2.4 不同年齡段患者預后的多因素Logistic回歸分析分別以是否出現預后不良（賦值：無=0，有=1）、是否出現復發/死亡（賦值：無=0，有=1）為因變量，以CYP2C19 LOF等位基因攜帶情況（賦值：無=0，有=1）、高血壓史（賦值：無=0，有=1）、糖尿病史（賦值：無=0，有=1）、吸煙（賦值：無=0，有=1）、飲酒（賦值：無=0，有=1）、性別（賦值：女=0，男=1）、NIHSS評分（賦值：實測值）、血糖（賦值：實測值）、TC（賦值：實測值）、TG（賦值：實測值）、LDL（賦值：實測值）、HDL（賦值：實測值）、白細胞計數（賦值：實測值）為自變量，進行多因素 Logistic回歸分析，結果顯示，年齡≤60歲的患者中，CYP2C19 LOF等位基因、高血壓史、糖尿病史、吸煙、LDL水平可能是臨床預后的獨立預測因子（P＜0.05），見表7；年齡＞60歲的患者中，高血壓史、糖尿病史、飲酒、男性、血糖水平、HDL水平可能是臨床預后的獨立預測因子（P＜0.05），見表8。多因素Logistic回歸模型分析顯示，以是否出現3個月卒中復發/死亡為自變量（賦值：無=0，有=1），在控制CYP2C19 LOF等位基因、高血壓史、糖尿病史、吸煙、飲酒、性別、NIHSS 評分、血糖水平、TC水平、TG水平、LDL水平、HDL水平、白細胞計數（賦值情況同2.4）上述臨床混雜因素后，尚不能肯定CYP2C19 LOF是該類研究患者卒中后3個月卒中復發/死亡的獨立預測因子（P＞0.05），見表9。

表7 年齡≤60歲患者預后的多因素Logistic回歸分析Table 7 Multivariate Logistic regression analysis of factors possibly associated with the outcome in patients ≤ 60 years old

表8 年齡＞60歲患者預后的多因素Logistic回歸分析Table 8 Multivariate Logistic regression analysis of factors possibly associated with the outcome in patients aged ＞60 years

表9 患者卒中后3個月卒中復發/死亡多因素Logistic回歸分析Table 9 Multivariate Logistic regression analysis of factors possibly associated with stroke recurrence or death in patients three months after stroke

3 討論

氯吡格雷是一種噻吩并吡啶類前體藥物，作為一種經典的抗血小板聚集藥物，廣泛應用在心腦血管疾病的治療，且證實了其有效性和安全性。然而，在臨床上有部分患者接受氯吡格雷治療后仍發生缺血性卒中事件，考慮這些患者存在氯吡格雷抵抗（clopidogrelresistance，CR）。引起CR的原因眾多，其中藥物基因多態性被認為是CR最重要的內在因素［12］。CR的發生機制與氯吡格雷的代謝過程有關，氯吡格雷口服后約15%經兩步代謝轉化，由CYP2C19催化為具有抗血小板聚集效果的活性成分。既往國內外研究表明，*1型、*2型、*3型為氯吡格雷代謝相關CYP2C19酶的等位基因，其中，CYP2C19*2與*3變異型為功能變異型等位基因，該變異可降低CYP2C19酶活性，使其經肝臟代謝后的活性產物不足，從而出現CR［12-13］。在我國人群中，CYP2C19*2型、*3型的比例較國外人群高［14-15］。因此，CYP2C19基因多態性對我國急性缺血性腦卒中患者使用氯吡格雷治療的效果可能存在較大影響。然而，目前研究表明，CYP2C19基因多態性與不同臨床結局的相關性仍存在爭議［3-4］，同時，其在不同年齡人群或者不同腦卒中亞類中的作用尚不清楚。因此，本研究探討在不同年齡層接受氯吡格雷治療的大動脈粥樣硬化型小卒中患者中CYP2C19基因多態性與臨床預后的相關性。

卒中的臨床結局首先與不同的評估手段相關。mRS被認為更適合評估患者的長期臨床預后［16］，尤其在首次發生卒中或小卒中患者的長期隨訪中，其具有較高的臨床預測價值［17］。而且，該量表在不同測評者間的可靠性一致性較高，同時具有較高的臨床評測敏感性，對得出陽性結果的樣本量要求也較小［18］。因此，本研究使用mRS作為臨床預后的評價工具。國內外研究表明，除了CYP2C19基因多態性，臨床因素、細胞因素對缺血性腦卒中患者的臨床結局也有重要影響［19］。臨床因素包括患者并發癥的多少和嚴重程度，例如糖尿病、高血壓、高脂血癥、血糖、NIHSS評分等。因此，本研究納入臨床常見的缺血性腦卒中危險因素來控制臨床的混雜因素，結果顯示，NIHSS評分、血糖水平、LDL水平、白細胞計數、糖尿病比例、高血壓比例、CYP2C19基因多態性比例、吸煙比例在年齡≤60歲不同臨床預后的患者中存在差異，在＞60歲患者中，則在血糖水平、HDL水平、LDL水平、TG水平、糖尿病比例、高血壓比例、性別的比例上存在差異。提示這些指標可能是影響臨床結局的重要因素，與既往研究結論一致［20-21］。細胞因素方面主要包括血小板更新速度、肝臟代謝酶水平等。本研究結果同時顯示，隨著年齡分層的改變，CYP2C19基因多態性和長期功能預后的相關性在年齡層間存在異質性，提示在接受氯吡格雷治療的大動脈粥樣硬化型小卒中患者中，年輕患者的長期功能預后與CYP2C19功能變異型等位基因的相關性可能較年老患者更強。目前直接探索其相關機制的國內外研究尚無報道，推測其原因可能為肝臟代謝酶水平的高低在其中發揮了重要作用。國外研究發現，實驗動物和人體中CYP的酶活性在年老組中均大幅下降［5-6］，因而CYP2C19基因多態性對CYP2C19酶活性的影響在年輕患者中可能更明顯。本研究結果還顯示，在年齡≤60歲的患者中，CYP2C19 LOF等位基因、高血壓史、糖尿病史、吸煙、LDL水平均可能是長期功能預后的獨立危險因素。而在年齡＞60歲的患者中，高血壓史、糖尿病史、飲酒、男性、血糖水平、HDL水平可能是長期功能預后的預測因子。該結論與既往研究結果一致［22-23］，表明臨床的長期功能預后是多種因素協同作用的結果，在不同年齡層中的影響因素也不盡相同。推測其原因可能為年齡對動脈粥樣硬化的形成存在一定的影響。顱內動脈粥樣硬化發生的時間較顱外動脈更晚［24-25］，且顱內動脈對高膽固醇血癥誘發脂紋形成的耐受性更好，動脈粥樣硬化斑塊破裂等血栓誘導事件發生率更低［24，26］。因此，氯吡格雷的抗血小板治療可能在年輕的大動脈粥樣硬化型小卒中患者中更有效。最后，本研究結果顯示，雖然在所有研究患者中，不同基因攜帶患者3個月卒中復發/死亡比例有差異，然而尚不能肯定CYP2C19 LOF等位基因是該類研究患者卒中后3個月卒中復發/死亡的獨立預測因子。原因可能與研究人群樣本過少，缺乏對研究人群服藥依從性、影響氯吡格雷療效的其他藥物使用情況等記錄有關。例如，質子泵抑制劑（PPIs）及鈣離子拮抗劑（CCBs）可能會因共同競爭CYP2C19的同一結合位點而發生與氯吡格雷藥物間的相互作用［27-28］。

綜上所述，本研究發現CYP2C19 LOF等位基因是接受氯吡格雷治療的大動脈粥樣硬化型小卒中患者長期功能預后不良的危險因素，該因素的影響可能與年齡呈負相關。同時，不同年齡層該類患者長期功能預后的獨立危險因素也不盡相同，對該類型患者提供的二級預防策略可能需要綜合年齡方面考慮。本研究存在以下局限性：研究的樣本量較少、選擇偏倚及單中心住院患者。此外，血漿中的氯吡格雷活性代謝物濃度并未檢測，在基線資料和后期的隨訪中，影響氯吡格雷藥物活性的藥物、其他基因攜帶信息未做記錄和測試。最后，一些非基因相關因素如飲食習慣、環境因素等也未做相應的記錄和校正。因此，未來還需擴大樣本量，并通過多中心研究來進一步證實該結論，為臨床提供更有力的數據支持。

作者貢獻：秦義人進行論文構思撰寫、設計和實施研究、數據采集、統計分析、經費支持；王達鵬采集分析數據、指導論文修改；趙紅如、方琪進行研究指導、論文指導、額外績效支出。

本文無利益沖突。