成人社區獲得性肺炎合并呼吸道病毒感染住院患者病毒譜及臨床特征分析

何燕超，張靜，馮凈凈，梅周芳，錢凌，黃琦慧，揭志軍

社區獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是成人最常見的感染性疾病，既往流行病學調查顯示CAP重癥患者的病死率達20%～30%，其中有不少病例的病原學仍不明確［1］。由于既往受限于檢測手段，目前對CAP病原學認知主要集中在細菌、真菌等領域，但對于病毒的認知較少。近年來，隨著核酸檢測的發展，呼吸道標本病毒檢測技術得到長足進展，多重聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法可以對單樣本進行多種病毒檢測［2］。過去數年來的國外一些研究發現CAP患者合并呼吸道病毒感染率超過四分之一，這更新了臨床對呼吸道病毒感染的認知［3-5］。

在我國，呼吸道病毒核酸檢測普及面仍不足，相關研究仍較少，北京地區做了初步的細菌、支原體等常見病原體引起的CAP合并呼吸道病毒感染病毒譜研究，發現其發病率與國外研究類似，但其臨床特征未有進一步的分析［6］。因此，為了闡明我國CAP合并呼吸道病毒感染患者的臨床特征并尋找是否存在特異性的生物標記物，本研究通過分析CAP患者合并呼吸道病毒感染情況，以及比較病毒陽性組與病毒陰性組的臨床特征和生物標記物的差異性，希望從中發現一些對于臨床診斷與治療有價值的信息。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年6月—2019年5月復旦大學附屬上海市第五人民醫院住院部收治的CAP患者276例。納入標準：（1）符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016年版）》（以下簡稱CAP指南）［7］的診斷標準并按照CAP指南進行診治：①社區發病。②肺炎相關臨床表現：a.新近出現的咳嗽、咳痰或者原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；b.發熱；c.肺實變體征和/或聞及濕啰音；d.外周血白細胞計數＞10×109/L或＜4×109/L，伴或不伴細胞核左移。③肺部影像學檢查顯示新出現的斑片狀浸潤影、葉或段實變影、磨玻璃影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。符合①、③及②中任何1項，并除外肺結核、肺部腫瘤、非感染性肺間質性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸粒細胞癥及肺血管炎等疾病。（2）年齡≥18周歲。（3）達到了CAP指南［7］建議住院治療的標準。（4）患者同意參加本次調查，并自愿接受實驗室檢測和病原學檢查。排除標準：（1）過去90 d內曾住院或長期依賴護理者。（2）現處于免疫抑制狀態（包括HIV感染、應用免疫抑制劑、腫瘤化療）的患者。（3）已知或疑似活動性肺結核患者。（4）懷孕或哺乳期。根據納入與排除標準剔除52例患者，最終納入223例CAP患者，其中男115例，女109例；年齡18～95歲，平均年齡（52.4±20.7）歲。另從上海市閔行區江川社區體檢人群中選取24例健康成人為對照組，其中男12例，女12例；年齡39～64歲，平均年齡（48.6±6.9）歲；納入標準：近2周內無感染表現，胸部影像學亦未發現上述③中改變。本研究經復旦大學附屬上海市第五人民醫院倫理委員會批準〔（2017）倫審（049備）〕，所有研究對象已簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集并記錄研究對象的一般情況（包括年齡、性別、吸煙史、合并癥等）、癥狀評估（咳嗽、咳痰、卡他癥狀）、體征評估（體溫、脈搏、呼吸頻率、血壓）、實驗室檢查結果（包括血常規、肝功能、凝血功能、血氣分析等）、抗生素使用時間、住院時間及疾病轉歸等。

1.2.2 咽拭子處理 采集受試者咽拭子標本后放入內含3 ml的 MEM 轉運培養液（含 1 mg/ml慶大霉素、1 000 U/ml青霉素、2.5 μg/ml兩性霉素B和2%胎牛血清）的帶旋蓋試管中，暫時存放在-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 呼 吸 道 病 毒 核 酸 檢 測 采 用 High Pure Viral Nucleic Acid試劑盒（瑞士羅氏公司）抽提咽拭子標本中的DNA/RNA，抽提物用50 μl洗脫液溶解，立即放入-80 ℃冰箱保存備用。采用多重巢式反轉錄酶 - 聚合酶鏈式反應（nested multiplex RT-PCR）檢測試劑盒（日本TaKaRa公司）檢測8種（10型）呼吸道病毒，包括流感病毒A型（Flu A）、流感病毒B型（Flu B）、腺病毒（ADV）、呼吸道合胞體病毒A型（RSVA）、呼吸道合胞體病毒B型（RSVB）、鼻病毒（RhV），副流感病毒（PIV）、冠狀病毒（CoV）、博卡病毒（BoV）、偏肺病毒（MPV）。采用Prime Script Reverse Transcriptase Kit（日本 TaKaRa 公司）進行反轉錄反應，PCR的反應程序根據說明書推薦進行。

1.2.4 細胞因子檢測 采用Merck Millipore人類細胞因子/趨化因子試劑盒（96孔板，美國RayBiotech公司）檢測白介素（IL）-6、IL-8、IL-10、干擾素（IFN）-γ、干擾素誘導蛋白（IP）-10和腫瘤壞死因子（TNF）-α等水平。采用Luminex200TM（美國Luminex公司）分析結果并儲存。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件及GraphPad.cameyo 6.0軟件進行數據分析和統計學處理。計數資料以相對數表示，兩組比較采用χ2檢驗（含校正公式）或Fisher's確切概率法，3組比較采用χ2檢驗，對于有統計學差異采用χ2分割法和Bonferroni校正進一步進行兩兩比較，對于超過20%理論頻數＜5或理論頻數＜1的樣本采用Fisher's確切概率法；計量資料正態分布以（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，3組比較采用方差分析，對于有統計學差異采用SNK-q檢驗進一步行兩兩比較；計量資料偏態分布以M（QR）表示，兩組比較采用Mann-Whitney U檢驗，3組比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAP患者呼吸道病毒檢出情況及病毒譜分析 223例CAP患者中檢測到有61例（27.35%）合并呼吸道病毒感染，其中58例（26.01%）為單病毒感染，3例（1.35%）為多種病毒感染（分別是 Flu A+RhV，Flu A+Flu B，RSVA+ RhV+CoV）。單病毒感染中22例（9.87%）為Flu A、14例（6.28%）為RhV、9例（4.04%）為Flu B、5例（2.24%）為ADV、2例（0.90%）為CoV、2例（0.90%）為 RSVA、2例（0.90%） 為 MPV、1例（0.45%） 為BoV、1例（0.45%）為RSVB，PIV未檢出。

2.2 CAP患者呼吸道病毒檢出與年齡的關系 依據CAP指南老年標準［7］將CAP患者分為非老年（≤65歲）組158例和老年（＞65歲）組65例，兩組患者病毒檢出率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 老年與非老年CAP患者呼吸道病毒檢出情況比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of the respiratory virus detected in elderly and nonelderly patients with community acquired pneumonia

2.3 CAP患者呼吸道病毒檢出與季節的關系 研究時間為2017年6月—2019年5月，按春（3—5月）、夏（6—8月）、秋（9—11月）、冬（12—2月）四季劃分，CAP患者四季均會有呼吸道病毒感染，其中冬季為高發季節，其后依次為秋季、夏季、春季，感染病毒主要有Flu A、RhV、Flu B，見表 2。

表2 223例CAP患者中檢出的病毒與季節的關系（例）Table 2 Relationship between viruses detected and seasons in 223 patients with community acquired pneumonia

2.4 CAP患者臨床特征分析 按照呼吸道病毒檢測結果將223例CAP患者分為病毒陽性組61例和陰性組162例。病毒陽性組死亡率高于陰性組，差異有統計學意義（P＜0.05），其中病毒陽性組死亡患者均為合并流感病毒感染；兩組年齡、性別、吸煙比例、合并癥比例、咳嗽比例、咳痰比例、卡他癥狀比例、體溫、脈搏、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血紅蛋白、C反應蛋白、紅細胞沉降率、降鈣素原、D-二聚體、谷氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、pH值、動脈氧分壓（PO2）、動脈二氧化碳分壓（PCO2）、血氧飽和度（SpO2）、抗菌藥物使用時間、住院時間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 病毒陽性組和病毒陰性組CAP患者的臨床特征比較Table 3 Clinical characteristics of virus-positive and virus-negative groups of community acquired pneumonia patients

因考慮死亡患者均合并流感病毒感染，遂進一步進行亞組分析。將呼吸道病毒陽性組分為流感組（包括Flu A和Flu B）31例和非流感組27例（不含多病毒感染3例患者），流感組、非流感組和病毒陰性組乳酸脫氫酶水平及死亡率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），其中流感組乳酸脫氫酶水平高于非流感組，流感組死亡率高于病毒陰性組（P＜0.05）；流感組、非流感組和病毒陰性組年齡、性別、吸煙比例、合并癥比例、咳嗽比例、咳痰比例、卡他癥狀比例、體溫、脈搏、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、血紅蛋白、C反應蛋白、紅細胞沉降率、降鈣素原、D-二聚體、谷氨酸氨基轉移酶、pH值、PO2、PCO2、SpO2、抗菌藥物使用時間、住院時間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 流感組、非流感組、病毒陰性組CAP患者的臨床資料比較Table 4 Comparison of clinical characteristics across virus-positive community acquired pneumonia patients with and without influenza infection，and virusnegative community acquired pneumonia patients

針對病毒陽性組和陰性組的影像學特征進行分析，結果顯示，病毒陽性組雙肺病變、多肺葉病變、斑片狀滲出影比例高于病毒陰性組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 病毒陽性組與病毒陰性組CAP患者的影像學特征比較〔n（%）〕Table 5 Imaging characteristics of virus-positive and virus-negative groups of community acquired pneumonia patients

2.5 CAP患者血清細胞因子分析 按對照組的性別、年齡等進行配對抽取呼吸道病毒陽性CAP患者24例和呼吸道病毒陰性CAP患者24例，比較病毒陽性組、病毒陰性組及對照組血清細胞因子水平，結果顯示，病毒陽性組、病毒陰性組、對照組的IL-10、IFN-γ和IP-10水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中病毒陽性組IL-10水平高于病毒陰性組，IL-10、IFN-γ、IP-10水平高于對照組，病毒陰性組IL-10、IP-10水平高于對照組（P＜0.05）；病毒陽性組、病毒陰性組、對照組IL-6、IL-8和TNF-α水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表6。

表6 病毒陽性組、病毒陰性組及對照組血清細胞因子水平比較〔M（QR），μg/L〕Table 6 Comparison of serum cytokine levels between virus-positive and virus-negative groups of community acquired pneumonia patients，and control group

3 討論

隨著PCR技術的發展，臨床對呼吸道病毒感染關注熱度逐漸上升，呼吸道病毒感染在CAP中的作用還有許多問題不清楚，需要進一步探索。近期國內相關指南建議，如在診治過程中不能排除病毒性肺炎，可積極采取抗病毒治療，尤其是流感［7］。然而，目前大多數呼吸道病毒缺乏有效藥物，如RhV、ADV、RSV和CoV等［8-9］。肺炎合并呼吸道病毒感染是否在臨床特征、臨床轉歸上有差異尚未可知。

本研究發現有27.35%的成人CAP患者合并呼吸道病毒感染，其中Flu A、RhV和Flu B最常見。國外一些研究報道亦發現成人CAP住院患者合并呼吸道病毒感染率為 20%～30%［10-11］，BURK 等［12］對 2003—2011年發表的31篇研究進行薈萃分析，結果顯示CAP合并呼吸道病毒感染率為24.5%，其中常見病毒類型與本研究結果基本一致。也有一些報道與本研究存在較大差異性，TEMPLETON等［13］研究顯示有56%的CAP住院患者合并呼吸道病毒感染。另外，本研究關于病毒感染的季節性分析發現，冬季為病毒感染的高發期，這與國外研究基本一致［14-15］。

本研究對呼吸道病毒感染CAP患者的臨床特征首次做了詳細地分析和報道。遺憾的是，并沒有在病毒陽性組和病毒陰性組的臨床特征中發現有特別價值的差異性。本研究觀察到病毒陽性組的住院時間、抗生素使用時間與病毒陰性組無統計學差異，但是死亡人數有統計學差異，由于病毒陽性組5例死亡病例均為合并流感病毒感染，進一步將病毒感染組按是否為流感病毒感染分為兩個亞組，亞組分析中，流感組死亡率高于非流感組和病毒陰性組，臨床特征顯示流感組乳酸脫氫酶水平高于非流感組。以上結果說明，對于流感病毒感染患者需要及時干預治療，乳酸脫氫酶升高可作為CAP是否合并流感病毒感染的參考因素。本研究又進一步分析病毒陽性患者與病毒陰性患者影像學特征，結果發現，病毒陽性患者更容易出現雙肺病變、多肺葉病變、斑片狀滲出影，這可能作為判斷CAP是否合并呼吸道病毒感染的參考依據。

另外，本研究對CAP合并呼吸道病毒感染的血清細胞因子進行了初步探索，篩選了6個常見的與病毒感染相關的細胞因子，并在病毒陽性組和病毒陰性組各隨機選取24例，同時選取24例健康體檢者作為對照組。結果發現，病毒陽性組IL-10升高且高于病毒陰性組和對照組，而IP-10、IFN-γ雖然相對對照組升高，但與病毒陰性組無統計學差異。已有研究發現IL-10為一種多功能的負向調節因子，主要由輔助性T細胞（Th2）分泌，可激活B淋巴細胞、單核細胞巨噬系統，在病毒感染中起到對抗炎性反應的作用［16-17］。以上結果說明IL-10可能是CAP患者合并呼吸道病毒感染的參考指標。

當然，本研究仍存在一定的局限性，咽拭子檢測呼吸道病毒僅局限于上呼吸道，很難排除是否合并病毒性肺炎，這可能會對本研究結果造成一定影響，但是病毒性肺炎多數預后不良，對抗細菌治療無反應［7］。

綜上所述，本研究發現CAP患者合并呼吸道病毒感染較為常見，其臨床特征無明顯差異，合并多數呼吸道病毒感染未發現影響轉歸，但合并流感病毒感染可能會導致死亡率增加，CAP合并呼吸道病毒感染在影像學上多表現為多肺葉、雙肺浸潤影，IL-10可能作為CAP合并呼吸道感染的預測指標。本研究在一定程度上更新了對CAP的認知，為判斷CAP合并呼吸道病毒感染提供了一些參考。

作者貢獻：何燕超、揭志軍進行文章的構思與設計，結果的分析與解釋，論文的修訂，負責文章的質量控制及審校；何燕超、張靜進行研究的實施與可行性分析，進行統計學處理；何燕超、張靜、馮凈凈、梅周芳、錢凌、黃琦慧進行數據收集；張靜進行數據整理；何燕超撰寫論文，進行英文的修訂；揭志軍對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。