真實(shí)世界中新型冠狀病毒抗體檢測結(jié)果的探究

戴菊華，林博之，孫新平

本文的創(chuàng)新點(diǎn)：

該研究針對新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）早期，采用膠體金法進(jìn)行新型冠狀病毒抗體檢測，臨床中確實(shí)有部分受檢者出現(xiàn)假陽性結(jié)果，提出嗜異性抗體這一較明確的干擾因素，對臨床有一定的價值。

本文的局限性：

（1）由于本中心不是COVID-19定點(diǎn)醫(yī)院，納入的COVID-19確診病例數(shù)僅1例，僅是單中心研究，多中心研究擴(kuò)大樣本量會不會出現(xiàn)結(jié)果差異，尚需要進(jìn)一步深入研究。（2）未被嗜異性抗體阻斷試管（HBT）封閉住的抗體陽性患者可能還存在其他潛在未明確的干擾因素，造成假陽性結(jié)果，需進(jìn)一步研究。

國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］提及新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）確診病例在原有核酸檢測和測序基礎(chǔ)上增加血清學(xué)檢測作為依據(jù)，并通過檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）特異性抗體來輔助診斷COVID-19。SARS-CoV-2抗體的檢測屬于血清學(xué)檢測的一種，包括膠體金法、化學(xué)發(fā)光法，抗體檢測對臨床實(shí)驗(yàn)室的操作要求相對于核酸檢測要低，可以快速、大量檢測，且可以在二級以下的基層實(shí)驗(yàn)室完成。因現(xiàn)狀是可用于SARS-CoV-2抗體檢測的試劑較少，而膠體金法操作便捷，只需15 min判讀結(jié)果，膠體金法被認(rèn)為是在快速篩查SARS-CoV-2感染中有效的方法［2］。目前批準(zhǔn)應(yīng)用的抗體檢測試劑盒中，基于抗體的免疫學(xué)方法存在相當(dāng)比例的假陽性情況，因此檢測試劑盒質(zhì)量和檢測過程的質(zhì)量控制均十分重要［3］?？贵w檢測結(jié)果假陽性可能包括患者自身因素、試劑原因以及標(biāo)本處理不當(dāng)?shù)仍?。嗜異性抗體、類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、自身抗體、血漿纖維蛋白等患者自身因素可能造成抗體檢測結(jié)果假陽性，也有可能因?yàn)樵噭┖锌乖奶禺愋曰蚩乖崛〉募兌惹芳言斐煽贵w檢測結(jié)果假陽性。故特異性免疫球蛋白M（IgM）/免疫球蛋白G（IgG）抗體必須進(jìn)行兩次以上的動態(tài)檢測，才能夠成為COVID-19在病毒核酸檢測陰性情況下輔助的確診標(biāo)準(zhǔn)［4-5］。目前北京大學(xué)國際醫(yī)院大多采用核酸聯(lián)合膠體金法抗體檢測用于復(fù)工復(fù)產(chǎn)體檢及入院患者的篩查。在控制好試劑和標(biāo)本因素的前提下，本文將對北京大學(xué)國際醫(yī)院SARS-CoV-2 IgM和/或IgG抗體結(jié)果陽性，但核酸檢測結(jié)果陰性患者的臨床資料進(jìn)行總結(jié)，探究SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果假陽性的原因。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年3—6月北京大學(xué)國際醫(yī)院同時送檢SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體和核酸的8 678例受檢者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，其中男3 968例、女4 710例?；颊咧饕獊碜园l(fā)熱門診、消化內(nèi)科、急診科、產(chǎn)科、口腔科等科室。排除標(biāo)準(zhǔn)：只檢測SARS-CoV-2抗體或核酸其中一項(xiàng)者。本研究經(jīng)北京大學(xué)國際醫(yī)院倫理審查委員會審核通過〔倫理批件號：2020-043（BMR）〕。

1.2 資料收集 收集受檢者臨床資料，包括流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)（SARS-CoV-2抗體和核酸檢測結(jié)果、類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、免疫球蛋白）。

1.3 研究方法

1.3.1 試劑與儀器 SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測采用膠體金法，抗體檢測試劑購于珠海麗珠試劑股份有限公司和北京英諾特生物技術(shù)有限公司。麗珠試劑所測結(jié)果由GS1201膠體金試紙分析儀自動判讀，儀器采用單反射光原理并綜合光電技術(shù)，獲取試紙條表面反射的信號，判讀值≥0.230 0時判斷為陽性，＜0.230 0為陰性?？贵w陽性復(fù)核采用磁微粒化學(xué)發(fā)光法，儀器采用Wan200+全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（儀器和配套試劑均購于廈門萬泰凱瑞生物技術(shù)有限公司），樣本S/CO＜1.0時，SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果判定為陰性；S/CO≥1.0時，SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果判定為陽性。核酸提取試劑購于常州金麥格生物技術(shù)有限公司，SARS-CoV-2核酸檢測采用熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，試劑（PCR-熒光探針法）購于圣湘生物科技有限公司和北京卓誠惠生生物科技股份有限公司。PCR擴(kuò)增采用羅氏Z480熒光PCR儀。嗜異性抗體阻斷試管（HBT）采用Scantibodies Laboratory Inc.，Heterophilic Blocking Tube，HBT-3IX762，批號：LSFF0041A。

1.3.2 標(biāo)本采集 研究對象均采集空腹靜脈血5 ml，置于含分離膠的黃頭真空采血管內(nèi)，充分混勻后靜置待血液凝固，2 500×g離心5 min。標(biāo)本無溶血、被細(xì)菌污染、貯存時間過長、凝固不全等現(xiàn)象。采集研究對象咽拭子標(biāo)本，采用一次性病毒采樣管，購于山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司，型號：MHII型（含滅活劑，2個拭子），規(guī)格3.5 ml，進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測。

1.3.3 血清學(xué)檢測 樣本血清檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體按照試劑盒說明書進(jìn)行，麗珠和英諾特試劑二者檢測結(jié)果均為陽性則認(rèn)為SARS-CoV-2抗體陽性，抗體陽性采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法復(fù)核。

1.3.4 SARS-CoV-2核酸檢測 采用RT-PCR技術(shù)，針對SARS-CoV-2基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）基因進(jìn)行檢測。咽拭子標(biāo)本和陰性、陽性質(zhì)控品的RNA抽提嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。核酸檢測結(jié)果Ct值判讀以廠家說明書建議為準(zhǔn)，對圣湘生物科技有限公司和北京卓誠惠生生物科技股份有限公司兩個廠家的試劑盒檢測核酸結(jié)果不一致的可疑結(jié)果應(yīng)送疾病預(yù)防控制中心進(jìn)一步確認(rèn)。

1.3.5 HBT使用方法 每個樣品用一個HBT，保持直立，輕彈底部，使管內(nèi)試劑全部聚集到底部。取下瓶蓋，吸取500 μl受檢者樣品加入試管底部，每個樣本更換一次吸頭，避免交叉污染，蓋好蓋子，輕輕翻轉(zhuǎn)震蕩5次，使樣品與試劑充分混合（每管中含有足夠的試劑，能滅活500 μl樣品中的嗜異性抗體），室溫孵育1 h。檢測處理后樣本，得到無嗜異性抗體干擾結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計學(xué)描述，計數(shù)資料以相對數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2抗體和核酸結(jié)果 8 678例受檢者中，8 677例SARS-CoV-2核酸檢測陰性，其中膠體金檢測SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者25例（0.288%），SARSCoV-2 IgG抗體陽性者5例（0.058%），SARS-CoV-2 IgM和SARS-CoV-2 IgG抗體同時陽性者0例；使用化學(xué)發(fā)光法復(fù)核后，僅3例（0.035%）SARS-CoV-2 抗體陽性，其中1例為膠體金法SARS-CoV-2 IgM抗體陽性（濃度：2.14 COI），2 例為膠體金法 SARS-CoV-2 IgG抗體陽性（濃度分別是：159.47 COI和 352.10 COI），其余27例均為陰性（0.311%）。1例受檢者SARSCoV-2核酸檢測陽性，N基因Ct值為26.18，ORF1ab基因Ct值為26.77，同時抗體IgM和IgG均為陰性，詳見表1。

表1 SARS-CoV-2抗體（膠體金法）和核酸檢測結(jié)果分析Table 1 SARS-CoV-2 antibody （colloidal gold method） and nucleic acid detection result analysis

2.2 SARS-CoV-2抗體陽性（膠體金法）受檢者的臨床特征分析及動態(tài)監(jiān)測 分析30例SARS-CoV-2抗體陽性受檢者的臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)史，30例受檢者均無流行病學(xué)史，其中有4例來自發(fā)熱門診，分別是3例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythemlatosus，SLE）患者和1例化膿性扁桃體炎患者。其余26例臨床上無發(fā)熱癥狀，無COVID-19影像學(xué)特征，無淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，不屬于疑似病例。30例SARS-CoV-2抗體陽性者進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，其中有10例IgM 抗體陽性是住院患者，進(jìn)行2次以上動態(tài)監(jiān)測結(jié)果仍為陽性，其余20例是門急診患者，未進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。

2.3 SARS-CoV-2抗體陽性（膠體金法）受檢者的類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、免疫球蛋白水平分析 分析30例SARS-CoV-2抗體陽性（膠體金法）受檢者的類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、免疫球蛋白的數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者的類風(fēng)濕因子水平均在參考范圍內(nèi)（＜10.1 U/ml）。除1例SLE患者疾病活動期補(bǔ)體C3降低外，其他29例受檢者補(bǔ)體 C3（0.9～1.8 g/L）、C4（0.1～0.4 g/L）水平均在參考范圍內(nèi)。3例SLE患者的IgG抗體水平稍升高（分別為 17.74 g/L、20.03 g/L、21.36 g/L），其余患者的 IgG（7.0～16.0 g/L）和 IgM（0.4～2.3 g/L）均在參考范圍內(nèi)。

2.4 HBT對SARS-CoV-2抗體陽性結(jié)果的影響 嗜異性抗體是一種內(nèi)源性干擾抗體，可與其他種屬的免疫球蛋白結(jié)合，包括作為免疫分析試劑的異源抗體，產(chǎn)生的途徑包括動物細(xì)胞輔助治療、注射疫苗、免疫抑制藥物、輸血、自身免疫性疾病、感染等，在體內(nèi)相對穩(wěn)定存在，具備一定的濃度，通常無病理生理作用，但在免疫學(xué)方法檢測中是重要的干擾因素［6］，普通人群嗜異性抗體的發(fā)生率為0.17%～40.00%［7］。采用HBT對SARSCoV-2抗體陽性（膠體金法）的標(biāo)本進(jìn)行處理后，25例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性的標(biāo)本中，除1例結(jié)果仍為陽性外（判讀值由0.302 1降為0.241 6），其余結(jié)果均轉(zhuǎn)為陰性（判讀值 ＜0.230 0），而 SARS-CoV-2 IgG抗體陽性的結(jié)果均依然為陽性（判讀值＞0.230 0）。其中臨床上進(jìn)行2次以上動態(tài)監(jiān)測的10例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性的標(biāo)本經(jīng)HBT處理后均為陰性。

3 討論

抗體檢測結(jié)果假陽性或核酸檢測結(jié)果假陰性存在，均是無法完全避免的，因此建議為滿足臨床診斷的特異度和靈敏度時，可以聯(lián)合運(yùn)用抗體篩查和核酸檢測方法，實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2感染的快速篩查與鑒別［8-10］。實(shí)驗(yàn)室SARS-CoV-2核酸和抗體的檢測結(jié)果是COVID-19臨床診斷的重要依據(jù)，但臨床依然需要根據(jù)流行病學(xué)史、臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果綜合判斷，不能僅靠單一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，尤其要考慮抗體假陽性的可能。

30例采用膠體金法檢測SARS-CoV-2抗體陽性的受檢者均無流行病學(xué)史，且同時SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果均為陰性，排除感染SARS-CoV-2或既往感染SARS-CoV-2的可能，因此本研究認(rèn)為這30例抗體檢測結(jié)果為假陽性。嗜異性抗體干擾免疫學(xué)方法檢測的原理是在抗原不存在的情況下，嗜異性抗體可與試劑中抗體Fc或者F（ab）段的決定簇非特異性結(jié)合，橋接捕獲抗體和檢測抗體，從而干擾免疫反應(yīng)，使得結(jié)合到固相的標(biāo)記抗體濃度升高，造成假陽性結(jié)果［6，11-12］。本研究采用HBT對30例膠體金法檢測SARS-CoV-2抗體陽性的標(biāo)本進(jìn)行處理后重新再檢測，其中24例抗體轉(zhuǎn)為陰性?？赡苡幸恍悠肪哂泻芨邼舛鹊氖犬愋钥贵w干擾，在這種情況下，HBT可能無法完全阻斷嗜異性抗體干擾。應(yīng)該設(shè)計不同濃度梯度的嗜異性抗體封閉劑，但本研究所用HBT說明書提示每管中含有足夠的試劑，能滅活500 μl樣品中的嗜異性抗體，因此未進(jìn)行倍比稀釋。本研究著重分析了沒有被HBT封閉住的1例IgM陽性和5例IgG陽性的受檢者，沒有被HBT封閉住的1例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者是一名女性，77歲，合并患有高脂血癥、高血壓、腦梗死、動脈粥樣硬化等多種基礎(chǔ)疾病，因白內(nèi)障待行人工晶狀體植入術(shù)就診，無發(fā)熱和/或呼吸道癥狀等COVID-19相關(guān)臨床表現(xiàn)，無COVID-19影像學(xué)特征，無淋巴細(xì)胞數(shù)目減少，既往未感染SARS-CoV-2，因此可以排除感染SARS-CoV-2。5例SARS-CoV-2 IgG抗體陽性者中1例以發(fā)熱、咽痛起病，臨床診斷為化膿性扁桃體炎，抗生素治療后好轉(zhuǎn)，排除感染SARS-CoV-2或既往感染SARS-CoV-2可能，其余4例受檢者臨床上無發(fā)熱癥狀，無COVID-19影像學(xué)特征，無淋巴細(xì)胞數(shù)目減少。以上6例受檢者均無流行病學(xué)史，且做SARS-CoV-2抗體檢測的同時均采樣進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測，檢測結(jié)果均為陰性。因此，本研究考慮可被HBT封閉住的24例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者結(jié)果為嗜異性抗體干擾導(dǎo)致的假陽性可能性大，而沒有被HBT封閉住的1例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性患者及5例SARS-CoV-2 IgG抗體陽性患者可能還存在其他潛在未明確的干擾因素，造成假陽性結(jié)果，需要進(jìn)一步研究。這為臨床醫(yī)生提供了對SARS-CoV-2抗體陽性結(jié)果分析解讀的經(jīng)驗(yàn)，建議臨床醫(yī)生一定要結(jié)合受檢者的流行病學(xué)調(diào)查、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)及影像學(xué)資料等綜合進(jìn)行分析及診斷。同時應(yīng)考慮到實(shí)驗(yàn)室的各種指標(biāo)是在COVID-19患者感染后的不同階段才能出現(xiàn)變化，還應(yīng)知曉實(shí)驗(yàn)結(jié)果會受到許多因素的干擾。

嗜異性抗體可以與試劑中的免疫球蛋白結(jié)合，干擾體外免疫檢測，與膠體金試劑相比，化學(xué)發(fā)光法試劑中含有消除干擾的抑制劑，使假陽性樣本的存在可能性減小。因COVID-19疫情早期，膠體金法檢測SARSCoV-2抗體首先獲國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床；化學(xué)發(fā)光法檢測SARS-CoV-2抗體是后續(xù)被批準(zhǔn)用于臨床，且還需要配套的儀器。本研究SARS-CoV-2抗體陽性樣本采用不同廠家膠體金試劑進(jìn)行復(fù)檢，并同時進(jìn)行核酸檢測。本研究再將30例膠體金法檢測陽性標(biāo)本采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行復(fù)檢后，結(jié)果提示只有3例抗體陽性，抗體假陽性率明顯減低，這提示膠體金法檢測新冠抗體受嗜異性抗體干擾大于化學(xué)發(fā)光法。

干擾免疫學(xué)方法檢測系統(tǒng)導(dǎo)致假陽性結(jié)果的內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多，最常見于類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、免疫球蛋白、自身抗體等，通過非特異結(jié)合干擾檢測過程?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第八版）》［13］提到體內(nèi)存在干擾物質(zhì)如類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體、補(bǔ)體、溶菌酶等，抗體檢測可能出現(xiàn)假陽性。本研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)30例SARS-CoV-2抗體假陽性受檢者的類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、免疫球蛋白水平基本均在參考范圍內(nèi)。因此本研究推測類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、免疫球蛋白不是引起SARS-CoV-2抗體檢測假陽性的首要原因。

由于存在可能導(dǎo)致SARS-CoV-2抗體檢測假陽性的情形，《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》［13］強(qiáng)調(diào)抗體檢測的前提條件是，臨床懷疑COVID-19且核酸檢測陰性的患者及病情處于恢復(fù)期且核酸檢測陰性的患者可通過抗體檢測進(jìn)行診斷。國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的SARS-CoV-2抗體檢測試劑說明書中也指出抗體檢測僅用作對SARS-CoV-2核酸檢測陰性疑似病例的補(bǔ)充檢測指標(biāo)或疑似病例診斷中與核酸檢測協(xié)同使用，不能作為COVID-19確診和排除的依據(jù)，不適用于一般人群的篩查。一般不單獨(dú)以血清學(xué)檢測作為診斷依據(jù)，需結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和基礎(chǔ)疾病等情況進(jìn)行綜合判斷。血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測是SARS-CoV-2核酸檢測假陰性的有效互補(bǔ)［14］?？贵w的產(chǎn)生有一定的時期，抗體檢測結(jié)果還可幫助識別COVID-19患者的感染階段［15］。我院確診1例非典型癥狀的輕型COVID-19患者，有高風(fēng)險小區(qū)密切接觸史，臨床表現(xiàn)有鼻塞、流涕、咳嗽，有黃痰，無發(fā)熱。其出現(xiàn)癥狀1 d后采樣發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2核酸陽性，而同時查IgM和IgG抗體均為陰性。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》［13］提到“SARS-CoV-2特異性IgM抗體、IgG抗體在發(fā)病1周內(nèi)陽性率較低”，因此考慮該患者可能是處于早期感染，尚未產(chǎn)生抗體，而不是抗體檢測假陰性。后續(xù)動態(tài)監(jiān)測該患者抗體，2周時IgM結(jié)果為弱陽性，IgG抗體陰性，1個月時檢測抗體均為陰性。

本研究通過探究SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果的干擾因素，發(fā)現(xiàn)嗜異性抗體可能是導(dǎo)致膠體金法檢測SARSCoV-2抗體IgM假陽性的主要原因，在臨床實(shí)踐中，特別是非COVID-19疫情流行區(qū)域，當(dāng)遇到SARS-CoV-2抗體陽性的情況，除了可以動態(tài)監(jiān)測抗體結(jié)果的變化及動態(tài)觀察患者的臨床情況，還可以采用HBT對SARSCoV-2抗體陽性的標(biāo)本進(jìn)行處理，從而減少SARSCoV-2抗體假陽性報告率。而SARS-CoV-2抗體IgG假陽性原因需要進(jìn)一步研究。臨床在分析解讀SARSCoV-2抗體檢測陽性結(jié)果時，一定要考慮實(shí)驗(yàn)的干擾因素，非疑似COVID-19患者或確診COVID-19患者不宜進(jìn)行SARS-CoV-2抗體檢測指導(dǎo)臨床。

作者貢獻(xiàn)：戴菊華進(jìn)行課題的構(gòu)思與設(shè)計，文獻(xiàn)查詢，撰寫論文；林博之進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理；戴菊華、孫新平負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。