兔輪狀病毒、兔腸冠狀病毒雙重RT-PCR檢測方法的建立及初步應用

趙巧雅，宋丹丹，劉麗萍，郭效珍，劉存霞，盛 媛，史玉穎，黃 兵*

(1.山東省農業科學院 家禽研究所，山東 濟南 250023；2.山東農業大學 動物科技學院，山東 泰安 271018)

兔輪狀病毒(lapine rotavirus，LaRV)是呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，可感染各日齡兔尤其是1～2月齡幼兔[1]，造成腹瀉[2]。該病傳播迅速，發病急、發病率高，四季均可發生。兔腸冠狀病毒(rabbit enteric coronavirus，RECV)為冠狀病毒科冠狀病毒屬病毒，最早于1980年在加拿大腹瀉癥狀幼兔身上發現[3]，后在健康兔中也觀察到該病毒[4]。兩者均是引起仔兔腹瀉的重要病原，臨床癥狀極為相似且存在混合感染情況，僅僅根據臨床上的方法難以進行鑒別和診斷。目前，已有RT-PCR、熒光定量RT-PCR及LAMP等方法對牛輪狀病毒[5]、豬輪狀病毒[6]、牦牛源輪狀病毒[7]、豬冠狀病毒[8]、大鼠冠狀病毒[9]等進行檢測，而關于LaRV和RECV的雙重RT-PCR檢測方法在我國尚未見報道。

輪狀病毒基因組編碼6種結構蛋白和5種非結構蛋白。NSP3基因較為保守，人輪狀病毒[10]、豬輪狀病毒[11]等均針對NSP3基因建立了相關檢測方法。N蛋白是一種堿性磷蛋白，是冠狀病毒粒子主要結構蛋白之一，既具有高度保守性,又具有很強的免疫原性，在病毒RNA合成中發揮作用[12]，常用于抗原檢測[13]。據報道，檢測臨床樣本時N基因檢測的靈敏度比ORF1b基因高10倍左右[14]。因此，本試驗針對輪狀病毒的NSP3基因、冠狀病毒N基因設計特異性引物，建立了LaRV和RECV雙重RT-PCR檢測方法，并在山東部分規模化兔場采集樣品進行檢測，為LaRV和RECV的疫情監控、臨床檢測及流行病學提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品、病毒及菌株2020年4-7月，從10個山東規模化兔場采集107份腹瀉兔糞便樣品，所有樣品單獨分裝，4℃保存送至實驗室檢測。……