美花風毛菊的抗肝癌活性研究

葉中天，李樂，付書正，劉金平,2，李平亞,2，劉云鶴,2※

（1.吉林大學藥學院，吉林 長春 130012；2.吉林大學天然藥物研究中心，吉林 長春 130021）

肝癌是全球第4大致死性惡性腫瘤，居全球癌癥病死率的第3位，惡性程度高，復發率高，易轉移，嚴重危害著人們的生命健康[1-4]。雖然肝癌的化學藥物治療已經有了很大的進展，但仍存在耐藥性強及毒副作用大等問題[5]。美花風毛菊[Saussurea pulchella（Fisch.）Fisch]為菊科風毛菊屬多年生草本植物[6]，廣泛分布于中國、韓國和俄羅斯。近年研究表明，從美花風毛菊中分離得到的化合物具有顯著的抗腫瘤活性[7]。作為一種天然植物，美花風毛菊具有多途徑、多環節和多靶點的優勢[8,9]。民間常用于治療肝炎、關節炎和高血壓等疾病[10,11]，但未見有關美花風毛菊抗肝癌活性的研究報道。本文以人肝癌HepG2細胞株和H22肝癌荷瘤小鼠為研究對象，評價美花風毛菊乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位（ESP）的體外和體內抗肝癌活性，為美花風毛菊的進一步開發與利用提供理論依據與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人肝癌HepG2細胞株和H22肝癌細胞均購自中國科學院（上海）典型培養保存委員會細胞庫。

1.1.2 動物 SPF級昆明小鼠，雌性和雄性，體重18~22 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。所有實驗操作均按照吉林大學《實驗動物管理和使用指南》進行。

1.1.3 材料與試劑 美花風毛菊的干燥全草（風干）在2018年9月中旬采摘于吉林省磐石市煙筒山鎮石棚村，經吉林大學藥學院李平亞教授鑒定為[Saussurea pulchella（Fisch.）Fisch]，樣品標本保存于吉林大學天然藥物研究中心；環磷酰胺（CTX）購自Sigma公司；胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養基購自GIBCO公司；青霉素和鏈霉素購自Solarbio公司；DMSO購自鼎國昌盛生物技術有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-（TNF-）、血管內皮生長因子（VEGF）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、血尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 ESP的制備 取干燥美花風毛菊全草1.0 kg，粉碎，加10倍量70%乙醇，加熱回流提取3次，每次3 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，再用3倍體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓回收，蒸干，得到美花風毛菊乙醇提物的乙酸乙酯萃取部位。

1.2.2 HepG2細胞的培養 使用DMEM高糖培養基，添加10%FBS、100 mg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，在37℃、5%CO2條件下培養24 h，取對數生長期的細胞進行實驗[12，13]。

1.2.3 對HepG2細胞增殖的影響測定 采用CCK-8法檢測ESP對HepG2細胞增殖的影響。將HepG2細胞以5 103個/孔的密度接種于96孔板中，放置培養箱內培養24 h。以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，配制濃度為0g/uL、20g/uL、40g/uL、60g/uL、80g/uL、100g/uL的ESP處理細胞，將96孔板放入37℃、5%CO2的培養箱中培養24 h后，加入含10%CCK-8繼續培養4h，用微板閱讀器在450 nm處測定吸光度值（OD值），并計算細胞抑制率。其計算公式為：細胞抑制率（%）=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/（對照組OD值-空白組OD值）]100%。再以細胞抑制率為縱坐標，各給藥劑量為橫坐標，繪制細胞增殖抑制曲線，并計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.4 皮下移植瘤模型的建立 在無菌條件下，用生理鹽水將H22肝癌細胞的濃度調整為5 106個/mL，并注射入小鼠腹腔。1周后，提取腹水腫瘤細胞，用生理鹽水稀釋成濃度為1 107個/mL的細胞懸液。稀釋后的腹水腫瘤細胞懸液按每只0.2 mL接種到小鼠的右前肢腋窩以建立荷瘤小鼠模型，未接種腫瘤細胞的小鼠用作正常對照組。

1.2.5 實驗分組及處理 接種后，將小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半：正常對照組（生理鹽水）；模型組（生理鹽水）；CTX組（20 mg/kg）；ESP低劑量組（100 mg/kg）；ESP中劑量組（200 mg/kg）；ESP高劑量組（400 mg/kg）。將CTX和ESP分別溶解于生理鹽水中，配制相應濃度的水溶液。每組小鼠每天灌胃1次，連續給藥14 d，給藥劑量均為20 mL/kg。

1.2.6 荷瘤小鼠體重、腫瘤重量、抑瘤率及臟器指數的測定 每天給藥前，測量小鼠體重。給藥14 d后，頸椎脫臼處死小鼠，并在無菌條件下對腫瘤、肝臟和腎臟進行快速分離和稱重。

腫瘤抑制率（tumor inhibition rate,TIR）的計算公式：TIR（%）=（模型組平均瘤重 給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重100%；

臟器指數計算公式：臟器指數（mg/g）=平均器官重量/平均體重。

1.2.7 小鼠血清TNF-、IL-2和VEGF含量的測定末次給藥24h后，從眼眶收集血液，在4℃、3 500 r/min的條件下進行離心獲得血清，并于﹣20℃儲存。測定方法參照TNF-、IL-2和VEGF酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明，采用雙抗體夾心法測定小鼠血清樣本中TNF-、IL-2和VEGF含量。

1.2.8 小鼠血清AST、ALT、CRE及BUN的測定測定方法參照AST、ALT、CRE及BUN試劑盒說明書。

1.2.9 組織病理學檢查 用10%中性福爾馬林緩沖液對每只小鼠的腫瘤、肝臟和腎臟進行快速固定，經HE染色后，用石蠟進行包埋，并切成厚度為5m的切片。在400倍顯微鏡下觀察腫瘤、肝臟和腎臟切片，并拍照記錄。

1.3 統計分析

采用SPSS 20.0進行統計學處理，組間差異采用單因素方差分析（one-way-ANOVA），組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。所有實驗數據表示為平均值±標準偏差。

2 結果

2.1 ESP對HepG2細胞增殖抑制的影響

ESP干預24 h、48 h和72 h的細胞抑制率變化見圖1。ESP分別處理24 h、48 h和72 h后，HepG2細胞的IC50分別為75g/mL、64g/mL和62g/mL（均P＜0.001）；從用藥濃度看，同一時間的ESP對HepG2的增殖抑制作用呈劑量依賴性，其中以100g/mL抑制率為最高；從用藥時間看，同一濃度的ESP對HepG2的增殖抑制作用亦呈時間依賴性，其中以72 h抑制率為最高。

圖1 ESP分別干預24 h、48 h、72 h后對HepG2細胞增殖的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of ESP on the proliferation of HepG2 after 24 h and 48 h,72 h intervention

2.2 對荷瘤小鼠各項指標的影響

各組荷瘤小鼠的體重、腫瘤重量以及肝、腎指數測定和計算結果見表1。

表1 各組小鼠的體重、腫瘤重量和肝、腎指數Table 1 The body weight,tumor weight,liver index and kidney index of each group

對體重的影響：與正常組比較，各組小鼠體重及體重增加均無明顯差異；與模型組比較，各組小鼠體重及體重增加也無明顯差異；與CTX組比較，ESP各組的體重增加較多，但無統計學意義（P＞0.05）。

對小鼠腫瘤重量的影響：從表中數據可見，模型組小鼠的重量最大。ESP各劑量組的腫瘤重量均低于模型組。其中，高、中劑量的ESP可顯著降低荷瘤小鼠的腫瘤重量（P＜0.01，P＜0.05），低劑量ESP干預的荷瘤小鼠的腫瘤重量雖小于模型組，但無統計學意義（P＞0.05）。通過腫瘤重量計算得到的腫瘤抑制率結果顯示，ESP低、中、高劑量組的抑制率呈現從低到高的趨勢，說明ESP的治療具有一定的劑量依賴性。

對肝、腎指數的影響：與正常組比較，CTX組小鼠的肝指數顯著上升（P＜0.001），說明接受CTX治療小鼠的肝受到較大影響；與模型組比較，ESP各組小鼠的肝、腎指數均有所降低，但無統計學意義（P＞0.05），說明ESP對小鼠的肝、腎指數影響較小；與CTX組比較，ESP高、中、低劑量組小鼠的肝指數顯著降低（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），說明ESP的肝毒性明顯弱于CTX。

2.3 ESP對小鼠細胞因子水平的影響

近年來的諸多研究表明，細胞因子具有廣泛的抗腫瘤活性。細胞因子TNF-、IL-2和VEGF與腫瘤的發生、發展及轉移均具有密切的關系，不僅能夠直接刺激腫瘤部位的免疫效應細胞和基質細胞，而且能夠增強腫瘤細胞的識別能力[14，15]。其中，TNF-在一定濃度范圍內具有組織修復功能，但TNF-濃度異常升高可引起組織損傷[16]。多類腫瘤細胞會產生TNF-，TNF-又進一步刺激腫瘤生長[17]。由表2可知，模型組的TNF-水平明顯高于ESP各劑量組（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），表明模型組的TNF-濃度異常升高；經過不同劑量的ESP干預后，TNF-水平顯著回調，且隨著劑量增加越接近于正常組水平，表明ESP可能通過回調異常升高的TNF-水平，減輕組織損傷，進而改善機體在荷瘤狀態下的免疫細胞活性，抑制腫瘤生長；與模型組相比，ESP高、中劑量組的IL-2水平顯著升高（P＜0.001，P＜0.05），表明ESP可能通過刺激T淋巴細胞的增殖和活化來發揮抗癌作用[18]；與模型組相比，CTX組與ESP高、中劑量組VEGF水平均顯著降低（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01），表明CTX和ESP能顯著抑制血清中VEGF的表達水平，并且可能通過有效減少腫瘤血管的生成來抑制腫瘤生長[19]。

表2 各給藥組對小鼠細胞因子水平的影響Table 2 The effect of each administration group on cytokine levels in mice

2.4 ESP對小鼠肝腎功能的影響

由表3可知，與正常組相比，模型組的AST、ALT、CRE和BUN的水平均顯著升高（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01，P＜0.001）；經CTX（P＜0.001）或ESP（P＜0.001）治療后，升高的水平可以顯著回調，其中ESP高劑量組的調節效果最好。上述結果表明，ESP表現出對肝臟的保護效果，而CTX雖然能夠顯著抑制腫瘤生長，但是對肝臟損害較大[20]。

表3 各給藥組對小鼠肝、腎功能的影響Table 3 The effect of each administration group on hepatic and renal function in mice

2.5 組織病理學檢查

通過HE染色，觀察腫瘤、肝臟和腎臟組織的病理變化（圖2）。腫瘤組織的切片結果顯示，模型組的腫瘤細胞呈不同形式的侵襲性生長，并且能夠檢測到有絲分裂活動和不同染色的腫瘤細胞[21]，而CTX組與ESP組中的大部分腫瘤細胞呈現壞死狀態。肝臟和腎臟組織的切片結果顯示，模型組的肝腎細胞空泡多，水腫，而CTX組與ESP組的肝腎細胞未見空泡和水腫，且細胞排列整齊、狀態良好[22]。上述結果說明ESP具有一定的抗腫瘤活性并且對小鼠的肝腎組織無明顯的毒副作用。

圖2 腫瘤、肝臟和腎臟組織的病理切片Fig.2 The histopathological studies of tumor,liver and kidney

3 討論

本研究利用人肝癌HepG2細胞株和H22肝癌荷瘤小鼠評估了美花風毛菊乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位的體外和體內抗肝癌效果。首先選用人肝癌HepG2細胞，以環磷酰胺為陽性對照藥，采用CCK-8法首次評價了ESP對腫瘤細胞增殖的抑制作用。研究結果表明，ESP具有顯著的體外抗腫瘤活性，且呈時間、劑量依賴關系。然后利用H22肝癌荷瘤小鼠模型，首次評價了ESP對腫瘤以及肝、腎組織的影響。研究結果表明，一方面，ESP具有顯著的體內抗腫瘤活性并且可呈劑量依賴性地抑制腫瘤生長，同時可以增加TNF-和IL-2含量以及減少VEGF含量，提示ESP可能通過提高免疫能力、抑制腫瘤血管生成而發揮抗肝癌的作用；另一方面，ESP可顯著回調荷瘤小鼠的ALT、AST、BUN以及CRE含量，提示ESP可明顯緩解荷瘤小鼠的肝組織和腎功能損傷。

綜上所述，美花風毛菊對肝癌具有抑制作用，并且可能是通過調節細胞因子的水平來發揮抗癌活性。與此同時，美花風毛菊乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位還表現出對肝臟和腎臟的保護效果。但是目前缺乏對美花風毛菊內發揮抗癌活性的物質進行準確鑒定以及抗癌機制的深入探討，因此，還需要進行更多相關的研究，為美花風毛菊的開發利用提供參考。