基于脾氣虛模型的四君子湯藥理作用研究進展

闞鴻，曲帥

（1.吉林農業大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112；3.吉林省生物研究所，吉林 長春 130012）

脾胃學說是中醫脾臟象理論的重要組成部分，傳統中醫理論認為脾為五臟六腑之一，是氣血生化之源，后天之本，主司運化、主統血、主肌肉四肢。現代理論[1,2]認為脾的生理功能可能涉及到3個方面:（1）直接方面，主要是包括消化系統及能量代謝直接相關的一切器官系統；（2）間接方面，主要是指肌肉組織、血液系統和免疫功能；（3）調節方面，主要與神經及內分泌系統有關。在各種疾病因素作用下，脾運化功能失常時，可在臨床上表現為脾氣虛證，即面黃食少、泄瀉或便秘、神疲乏力、少氣懶言、舌淡苔白及脈虛弱等現象，在現代醫學中則體現在胃腸道的消化吸收功能失調；神經、免疫、內分泌和運動等系統調節紊亂；營養物質代謝低下的虛損性疾病狀態，表現為多系統和多器官功能衰弱的綜合病理變化[3]。

近年來，脾氣虛理論、脾氣虛癥候本質及治療隨著中醫藥的現代化發展得到進一步深入地研究。健脾益氣是中醫治療脾氣虛證的基本方法，臨床上最經典的補脾益氣方劑為四君子湯。四君子湯出自宋代《太平惠民合劑局方》，由人參、白術、茯苓和炙甘草4味藥組成。方中人參大補脾胃之氣；白術助君藥人參燥濕健脾；茯苓健脾，滲濕利水；炙甘草和中益氣，四藥相輔，具有益氣健脾之功效，臨床上療效顯著。目前，四君子湯已經成為治療脾氣虛癥的研究熱點，其在器官水平、細胞水平和分子水平相關的藥理藥效研究也取得了一定的成果。因此本文從上述脾的3個方面生理功能，就近年來基于脾氣虛證中四君子湯的藥理作用相關研究進行綜述，以期為四君子湯以及治療脾氣虛證的相關研究提供參考。

1 脾氣虛證模型的建立

動物模型是表征中醫癥候模型、探究中醫理論及中藥藥效的主要手段。脾氣虛模型一般采用大鼠進行建模，其中以雄性Wistar大鼠，雄性SD大鼠最為常見，也有使用BALB/c雄性小鼠、昆明雌性小鼠、ICR小鼠、北京鴨和比格犬等動物進行造模[4,5]。造模方法主要有單因素造模法和復合造模法。單因素造模法即采用瀉下方劑及利血平等藥物或通過飲食、力竭法等單一方法刺激模型動物產生脾氣虛證；而復合造模法多利用藥物、飲食結合勞倦過度等方法聯合制備脾氣虛證，由于其癥狀更貼近于臨床、重復性好，因此成為目前脾氣虛證的主要造模方法。另外手術法和基因小鼠造模法也是研究脾氣虛癥的模型方法，但由于技術水平要求較高，目前沒有得到廣泛應用[6]。

造模成功的標準主要以《中藥治療脾虛證的臨床研究指導原則》《中藥新藥臨床研究指導原則》《大鼠脾虛證的內分泌研究》中脾氣虛的宏觀標準為指標進行判斷，主要包括便形質軟或溏稀；體重減輕、消瘦；食量減少；弓背，扎堆、蜷縮或瞇眼；毛無光澤，肛溫無明顯變化；游泳耐力下降等多項指標。隨著對脾氣虛證的深入研究，一些微觀指標例如木糖吸收率、免疫相關指標和血常規等指標也成為判斷模型成功的補充證據[6]。

2 脾氣虛證藥理作用研究進展

2.1 四君子湯對脾氣虛證消化系統及能量代謝方面的調節作用

中醫理論中脾最根本的本質主要體現在物質代謝和機體能量轉換。脾氣虛證最典型的病癥為胃腸功能失調紊亂，表現為消化吸收功能減弱等癥狀。四君子湯可從保護胃腸黏膜、調節消化系統的信號通路和維護胃腸道微生態等多方面對脾氣虛證進行改善治療。

脾氣虛證大鼠胃腸黏膜上皮會出現壞死和脫落，上皮細胞內含有大量自噬泡、胃腺和腸腺萎縮及黏膜下層水腫等現象[7]，因此，細胞凋亡對黏膜上皮、腺體的損傷、再生和修復有很大的影響，在胃黏膜防御屏障的第5級防線中起重要作用[8]。研究表明，多胺對胃腸黏膜屏障功能具有重要的調控作用[9,10]，四君子湯可在分子水平上調精胺合酶mRNA，提高脾氣虛證大鼠胃、腸黏膜多胺的含量，進一步提高胃黏膜緊密蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-3、粘附連接蛋白E-cadherin和-catenin的表達，降低大鼠胃黏膜caspase-3含量，抑制胃腸黏膜細胞凋亡，同時提高大鼠小腸黏膜三葉因子（TFF3）蛋白表達，促進受損胃腸黏膜的增殖與修復，增強胃腸黏膜的防御能力[11-15]。

在消化系統信號通路的研究上，陳玉龍等[16]發現四君子湯可恢復脾氣虛大鼠唾液淀粉酶的分泌；進一步對脾氣虛證大鼠腮腺中的VIP-cAMP信號通路研究發現，四君子湯可通過提高血管活性腸肽（VIP）含量，恢復cAMP和cAMP依賴蛋白激酶（protein kinase A，PKA）的活性，并提高PKA下游產物SNAP-23和VAMP-8蛋白表達，改善唾液淀粉酶的分泌障礙。四君子湯還可通過干預CNP-NPRB-cGMP信號通路，使大鼠血清中的C型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）含量減少，降低位于胃竇平滑肌細胞膜上的B型鈉尿肽受體（NPRB）的表達量，從而降低cGMP生成量，增強平滑肌自主收縮能力和大鼠胃排空能力；鈣調素-肌球蛋白輕鏈激酶（CaM-MLCK）信號系統是胃腸道平滑肌細胞收縮舒張的核心步驟，在CaM-MLCK通路中，四君子湯可降低平滑肌組織CaM、MLCK表達量和Mg2+-ATPase活性，舒緩胃平滑肌的高張力，間接促進胃腸動力[17,18]。另外，段永強等[19]研究表明，四君子湯可通過降低脾氣虛證大鼠血清、小腸中的P物質/膽囊收縮素（substance P/cholecystokinin，SP/CCK）含量，同時降低小腸MAPK14 mRNA相對表達量，調整MAPK信號通路，改善小腸蠕動速度，起到減少腹瀉的作用。由于脾氣虛證涉及多臟器、多系統，因此田茸等[20]將與機體多系統多臟器生理功能密切相關的鈣調蛋白信號傳導途徑關鍵基因鈣調蛋白/Ⅱ型鈣調蛋白激酶（calmodulin/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaM/CaMKⅡ）的表達作為檢測指標，從基因和蛋白水平對脾氣虛證癥候實質進行客觀化研究，發現四君子湯具有抑制脾氣虛證大鼠小腸組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達、促進脾氣虛證大鼠腦組織中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表達的作用，揭示了四君子湯可通過CaM信號傳導途徑作用于脾氣虛證中的腦腸微環境中，達到治療的作用。

脾氣虛證會引起腸道微生態失衡，菌群失調[21]。四君子湯可顯著升高腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌菌量，調節腸道菌群的生長，使其產生揮發性脂肪酸，進而達到抑制致病菌和營養維持腸道黏膜防御屏障的功能[22]。除此之外，運用腸桿菌基因間重復一致序列-聚合酶鏈式反應（ERIC-PCR）技術、動態追蹤分析及16SrDNA測序法和指紋圖譜法等現代技術分析腸道菌群多樣性變化后，發現四君子湯還可以通過提高腸道菌群的多樣性，營養腸道黏膜，增強腸道黏膜防御能力[23,24]。

劉友章[25]在80年代提出了脾主肌肉與線粒體有密切的關系，并報道了脾氣虛病人胃黏膜壁細胞線粒體數目減少、超微結構受損和能量代謝障礙，提出了中醫脾-線粒體相關學說，為脾氣虛的本質研究奠定了基礎。研究證實[26,27]脾氣虛證的病人及相關動物模型中動物胃黏膜中的主細胞和壁細胞、骨骼肌、心肌、十二指腸和肝細胞線粒體均可出現數目減少、腫脹、基質變淺、空泡變淡和嵴斷裂等超微結構的改變，經四君子湯治療后，脾氣虛病癥中的線粒體可以得到修復，形態和結構得到改善。

何麗娟等[28]采用酶聯免疫吸附劑測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠胃組織cAMP及ATP活性，分別采用實時熒光定量PCR法和蛋白質印跡法（western blot）檢測PKA、cAMP反應元件結合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，cREB）、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP）、磷酸化酶激酶（phosphorylase kinase，PHK）mRNA和蛋白的表達，結果表明四君子湯均可增強脾氣虛大鼠上述指標的表達，因此推測四君子湯治療脾氣虛證可能是通過激活胃cAMP-PKA信號轉導通路，使cREB以及GP磷酸化，加速糖原酵解，從而產生能量。另外在腸道中，四君子湯通過調節小腸黏膜能量代謝功能相關酶琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，改善脾氣虛模型大鼠尿木糖排泄率，提高小腸黏膜ATP的含量，來修復脾氣虛證中的能量代謝障礙[29,30]。

2.2 四君子湯對脾氣虛證肌肉、血液及免疫方面的調節作用。

“脾氣虛四肢不用”是脾氣虛證的癥候之一，表現出倦怠、乏力、納呆等脾氣虛癥狀。劉文俊等[31]認為“脾氣虛四肢不用”可能與AMPK/ULK1途徑激活的線粒體自噬水平提高不足有關，進一步通過對股四頭肌線粒體自噬研究發現，四君子湯可減少線粒體過度自噬，降低線粒體的代謝副產物活性氧（reactive oxygen species,ROS）的累積，并顯著降低股四頭肌細胞凋亡水平[32]。對脾氣虛模型大鼠的骨骼肌線粒體研究發現，過氧化物酶體增殖物激活受體-共激活因子-1（peroxisome proliferatoractivated receptor-coactivator-1,PGC-1）調控的信號通路異常，導致線粒體結構和功能的異常，呼吸鏈酶活性降低，線粒體氧化磷酸化下降，機體生物合成、能量代謝障礙，四君子湯可通過提高大鼠骨骼肌線粒體氧化磷酸化水平，修復骨骼肌線粒體損傷，同時升高大鼠骨骼肌線粒體超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和鈉-鉀ATP酶（Na+-K+-ATPase）活性，降低丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，減輕線粒體氧化損傷，調節機體能量代謝[33,34]。通過采用激光共聚焦技術檢測骨骼肌組織［Ca2+］i（細胞內Ca2+濃度）濃度發現，四君子湯可以升高［Ca2+］i濃度，同時提高脾氣虛證大鼠骨骼肌組織能量代謝相關酶Na+-K+-ATPase和鈣-鎂ATP酶（Ca2+-Mg2+-ATPase）活性，恢復骨骼肌組織Ca2+/CaM-CaMKⅡ信號通路關鍵分子CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白正常表達[35]。

脾氣虛的免疫學本質主要體現在紅細胞C3b受體水平下降，T淋巴細胞亞群比例失衡，淋巴細胞分化能力下降甚至處于抑制狀態，同時細胞因子表達異常，巨噬細胞功能受到抑制，免疫器官脾臟和胸腺的超微結構破壞[36]。

四君子湯能激活網狀內皮系統的吞噬功能，提高外周血中T淋巴細胞百分率[37]，明顯增加胃黏膜和外周血CD4+T細胞數量，降低CD8+T細胞的數量，使CD4+/CD8+比值升高，調節T淋巴細胞亞群的比例，增強胃黏膜免疫功能，防治慢性胃病的發生和發展[38,39]；同時增加胸腺指數和脾指數，提高機體免疫功能。針對脾氣虛證細胞因子的表達異常，有研究表明四君子湯還可以調節小腸組織中的細胞因子IL-1、IL-6、IL-2、IL-4和IL-8水平，提高體液免疫中的免疫球蛋白IgG、IgM和IgA，通過平衡參和細胞與體液免疫的細胞因子免疫應答，發揮小腸黏膜免疫防御和抗炎的作用[5,16,38,40]。趙寧等[41]研究表明四君子湯可以調節脾氣虛癥大鼠空腸黏膜內的細胞因子TNF-和TNF-的含量，糾正空腸內細胞因子網絡失衡，提高免疫抑制作用，增強機體的抵抗力和防御能力，使脾氣虛證模型大鼠免疫能力趨向于正常大鼠。

2.3 四君子湯對脾氣虛證神經、內分泌系統及其他方面的作用。

通常消化道系統黏膜損傷患者體內會出現5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）代謝異常，表現為血漿中5-HT、5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA）增高，尿中5-HIAA排泄降低，四君子湯可抑制血漿中5-HIAA升高，調節胃腸運動，作用于攝食中樞促進進食[42]。馮曉帆等[43]采用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）和ELISA的技術檢測了大鼠下丘腦及海馬中神經內分泌和免疫共同識別的信號物質P物質的含量以及mRNA的表達，結果顯示四君子湯治療組可顯著升高大鼠下丘腦和海馬中的P物質含量，提示四君子湯可通過調整脾氣虛型大鼠腦區的P物質的量，起到調節神經內分泌免疫功能的作用[44]。

內分泌系統產生的胃腸激素與生物體的消化機能息息相關，可以促進胃腸運動，增加消化能力。例如神經肽-內啡肽（-EP）參與胃腸運動、胃和胰腺的分泌、攝食行為和糖代謝等活動，具有應激適應和減輕應激所致中樞及外周病理損害的作用[45,46]；內原性縮血管活性肽神經肽（neuropeptide Y,NPY）在體內可刺激食欲、增強營養物質吸收，是胃腸道體液和電解質分泌的強抑制劑[47,48]；降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）是廣泛分布于胃腸部位的生物活性肽，可在胃黏膜受損時大量釋放，提高局部血流量，修復黏膜，還可以同時減少胃酸分泌，減輕受損黏膜的刺激[49,50]。四君子湯一方面可促進生長抑素（somatostatin,SS）、膽囊收縮素（cholecystokinin,CCK）、胃動素（motilin,MTL）、胃泌素（gastrin,GAS）、VIP和醛固酮的分泌，加速胃排空[51-54]；另一方面，四君子湯通過調節血漿-EP的含量，參與機體全身應激的調節，應激時起到保護急性胃黏膜損傷的作用，同時提高脾氣虛型大鼠血漿中的NPY含量，刺激食欲，改善CGRP的異常釋放，緩解脾氣虛證的胃腸功能和代謝紊亂[55]。

此外，四君子湯可通過改善胃黏膜血流量，升高血清SOD含量、降低血清MDA的含量[56]，恢復與增強體內抗氧化酶防御系統能力，增強機體清除自由基的能力，減輕脂質過氧化反應，實現對脾氣虛型慢性萎縮性胃炎的治療作用[57]。甄畢賢等[58]通過主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘運用代謝組學技術對脾氣虛型大鼠進行分析，發現四君子湯可以通過調整脾氣虛大鼠的脂類代謝、氨基酸代謝等多種代謝通路來完成其對脾氣虛證的治療作用。

3 總結與展望

脾氣虛證的本質是四君子湯發揮治療作用的理論基礎，四君子湯治病機制的探討也輔助認清脾氣虛證的本質，二者相輔相成，相互促進。目前脾氣虛證的模型建立成功與否多數依靠外觀觀察及行為學指標進行判斷，還不能夠完全模擬臨床上的癥狀。隨著脾氣虛證的本質的不斷深入研究，脾氣虛證模型可通過更客觀的檢測性指標來進行判斷和完善。目前，四君子湯的藥理作用研究主要集中在對消化系統及能量代謝方面上，其他方面例如對免疫系統及神經系統的調節，治療脾氣虛證的相關通路和機制需要進一步挖掘和完善。中藥復方雖然應用有上千年的歷史，但是由于其化學成分復雜，作用于多器官、多靶點，組方藥物之間具有高度協同性，因此需要不斷深入挖掘其藥效物質基礎，明確其治療疾病的機制與靶點，為推廣傳統方劑、開發利用中藥新藥及促進中醫藥的現代化發展奠定強有力的理論基礎。