培元通腦膠囊重金屬生物利用度研究及風險評估

李艷華，趙嘯虎，張紅梅

（1.吉林大學第一醫院日間觀察病房，吉林 長春 130021；2.吉林省藥品檢驗所，吉林 長春 130033；3.吉林大學第一醫院藥學部，吉林 長春 130021）

中成藥所含重金屬成分的作用具有兩重性，既可作為藥物的有效成分，又會對人體有一定的毒性，如朱砂中的汞和雄黃中的砷等。例如在化風丹中5種常見金屬元素中，日劑量的Pb元素少量超標，Hg元素和As元素超標較多[1]。由于化風丹處方中含有朱砂和雄黃，Hg元素和As元素分別為其主要成分，且實驗中含量測定樣品是經硝酸、雙氧水消解制備而成，制備條件不同于人體消化環境，結果中得到的金屬離子并不完全是人體吸收的部分，故不能認為人體吸收重金屬含量超標。中藥中的重金屬含量與其在體內的吸收含量是不同的，所含的重金屬是否會引起中毒取決于吸收的量，而不完全是其含量[2]?？诜o藥時，藥物溶出后被人體吸收（生物可利用部分）才可能產生毒性，如果測定總濃度而不考慮生物利用度，會高估重金屬對人體造成的健康風險[3]。

由于重金屬具有不易降解性、食物鏈傳遞性和積累性，所以動物類藥材重金屬超標率較植物類藥材更高[4]。培元通腦膠囊由制何首烏、熟地黃、天冬、龜甲（醋制）、鹿茸、全蝎、燙水蛭和地龍等中藥精制而成，既包含了植物藥也包含了動物藥。植物藥重金屬污染與藥材生長的環境條件有關，如大氣、土壤、水、農藥和化肥的施用等[5]。動物藥重金屬污染的原因，一方面是動物吃了受污染的植物藥，藥材含有有害重金屬，在生物體內容易蓄積，半衰期長，不易分解，在體內慢慢富集，造成重金屬超標；另一方面與動物藥材的遺傳特性有關，即對重金屬元素的主動吸收和富集。動物藥的生長環境易受重金屬的污染，特別是水蛭和地龍，具有較強的重金屬攝取和蓄積能力[6]。根據人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）頒布的Q3D對重金屬元素雜質的潛在毒性進行評估，提取重金屬元素雜質分類要求和殘留限度規定了各金屬元素的允許日暴露量[7]，其中1類重金屬元素因具有明顯毒性被評估為高風險元素，1類元素有砷（As）、鉛（Pb）、汞（Hg）和鉻（Cd）4種元素，因為中藥材生長和炮制過程中很容易富集銅（Cu）元素，所以本研究將Cu元素加入檢測。鑒于目前國內尚無對該藥品重金屬及有害物質檢測的文獻報道，本研究采用電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS），測定培元通腦膠囊中5種金屬元素含量并計算生物利用度，對培元通腦膠囊進行風險評估，本研究的總重金屬和可溶性重金屬的含量比較研究對中成藥的安全應用具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7700 series ICP-MS（美國Agilent公司）；MARS 5微波消解儀（美國CEM公司）；XS105DU型分析天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q純水儀器（法國Millipore公司）；DSHZ-300A恒溫振蕩器（天津市天大天發科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

培元通腦膠囊（江南羚銳制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字Z20000022，批號：1908112，1909061，1910301）規格為每粒裝0.6g。Cu單元素標準溶液（08615-17123，1 000g L-1）、As單元素標準溶液（08611-18021，1 000g L-1）、Cd單元素標準溶液（08612-16011，1 000g L-1）、Hg單元素標準溶液（08617-17032，1 000g L-1）、Pb單元素標準溶液（08619-18031，1 000g L-1），以上元素標準溶液均購自國家標準物質研究中心；金（Ar）元素標準溶液（17725，1 000g mL-1）購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；內標溶液為鉍（Bi）、鍺（Ge）、銦（In）標準品儲備液（23-170 VYY2，100 mg L-1）購自安捷倫公司，硝酸（優級純，美國默克公司），胃蛋白酶（BCBZ7879，SIGMA），胰蛋白酶（SLBW1439，SIGMA）。

2 方法

2.1 ICP-MS工作條件

等離子功率：1 450 W；等離子氣流速：15.0 L min-1；載氣流速：0.9 L min-1；霧化氣流速：0.85 L min-1；預混室溫度：2℃。其中Hg和Pb的內標為Bi，Cd的內標為In，Cu和As的內標為Ge。

2.2 標準溶液制備

表1 實驗用重金屬標準溶液濃度Table 1 The standard solution concentration of heavy metals for the experiment

2.3 培元通腦膠囊中重金屬含量待測液的預制備

精密稱取培元通腦膠囊內容物0.5 g，置于消解管內，加硝酸5 mL，雙氧水1 mL，混勻，置于微波消解儀內消解[1]。完成消解后，混合物冷卻至室溫，置于100 mL容量瓶中，將消解管用少量水洗滌3次并合并于容量瓶中，加入Ar元素標準溶液（1g mL-1）200L，用水稀釋至刻度，充分搖勻，即得。

除不加Ar元素標準溶液外，同法制備試劑空白溶液。

2.4 體外消化實驗

體外消化實驗方法主要參考2020年版《中華人民共和國藥典》第四部0921崩解時限檢查法中附錄來配制模擬胃、腸消化液[8]。

精密稱取培元通腦膠囊內容物0.5 g，置于50 mL離心管中與20 mL模擬胃液混合并震蕩1 min。混合物用恒溫振蕩器以250 r min-1在37℃振蕩4 h，后以4 000 g min-1離心5 min，用0.45m濾膜過濾上清液15 mL，置于4℃冰箱中，后采用ICP-MS分析待測液中的金屬含量，即為人工胃液中溶出含量。殘渣與20 mL模擬腸液混合，采取與模擬胃液相同的方法震蕩4 h，萃取，測定。

2.5 方法的線性關系、檢出限

以在線內標法對系列標準溶液和空白溶液（2%硝酸溶液）進行檢測。以元素的質量濃度（x，ng mL-1）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到各元素的線性回歸方程及相關系數，并以空白溶液所產生的信號響應的標準偏差（）的3倍所對應的待測元素質量濃度作為儀器的檢出限。

2.6 精密度試驗

取標準曲線第3點溶液，連續進樣6次，各元素含量RSD在0.90%~1.71%之間，表明儀器精密度較好。

2.7 穩定性試驗

精密稱取樣品（批號：1910301）0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、6、10、12、24 h時測定樣品含量。

2.8 重復性試驗

精密稱取樣品（批號：1910301）0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行試驗6份。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取培元通腦膠囊（批號：1910301）樣品0.5g，加各測定元素相應的對照品溶液適量，按照“2.3”中的步驟制備供試品溶液，分別平行制備6份。

2.10 健康風險評估

本研究采用美國環保署（US EPA）發布的目標危害熵值法（THQ）[9]對人群進行潛在健康風險評估。如果THQ＞1，則暴露人群有健康風險；如果THQ≤1，則沒有明顯的健康風險。THQ值越高表明污染物對人體健康的危害越大。本文根據美國EPA的導則和相關數據確定了風險評估計算所涉及的參數以計算THQ。

式（1）中，C為培元通腦膠囊在體外模型中重金屬質量分數（mg kg-1），EF（exposure frequency）表示平均每年暴露于含重金屬培元通腦膠囊的頻率（治療周期為30~84 d[10,11]，取最大值約84 d/年），ED（exposure duration）表示平均暴露含重金屬培元通腦的年數，FIR（food ingestion rate）表示含有重金屬培元通腦膠囊的日攝入量，WAB（average body weight）表示平均體重，TA（average exposure time for non-carcinogens）為平均接觸含重金屬藥物的時間，RFD（oral reference dose）代表非致癌污染物的安全劑量[9,12-14]。

當存在多個非致癌物質同時暴露時，不考慮相互作用，將每種污染物的非致癌風險相加，得到總危害商值（HI）。當HI＜1時，表示非致癌風險較??；當HI≥1時，表示非致癌風險較大。

3 結果與討論

3.1 線性和檢出限

表2結果表明，5種金屬線性關系良好，符合分析要求。

表2 Cu、As、Cd、Hg和Pb 5種金屬元素線性方程、線性范圍和檢出限Table 2 The linear equation,linear range and detection limit of five heavy metals including Cu,As,Cd,Hg and Pb

3.2 穩定性試驗

Cu、As、Cd、Hg和Pb的RSD分別為0.95%、1.21%、1.33%、1.54%和1.85%，表明5種元素在24 h內穩定性良好。

3.3 重復性試驗

Cu、As、Cd、Hg和Pb的RSD分別為0.95%、1.01%、1.07%、1.58%和1.66%，表明本方法重復性較好。

3.4 加樣回收率試驗

測定回收率在90.60%~101.17%之間，各元素的RSD在0.67%~3.88%之間，表明方法準確性較好，見表3。

表3 加樣回收率試驗結果Table 3 The result of the recovery test （n=6）

3.5 培元通腦膠囊中重金屬總量及生物利用度

取3批次樣品，測定樣品中、胃液中和腸液中各金屬的含量，每個樣品平行測定3份，計算各金屬總量及生物利用度，結果見表4。

表4 培元通腦膠囊中重金屬總量及生物利用度Table 4 The total content and bioaccessibility of heavy metals in Peiyuan Tongnao Capsules

由表4可以看出，重金屬生物可給量低于總重金屬總量，說明重金屬（Cu、As、Cd、Hg和Pb）在模擬人工胃腸液中不能完全被溶出吸收。重金屬生物可給量均值由高到低依次為Hg（3.49 mg kg-1）＞As（3.11mg kg-1）＞Cu（1.82mg kg-1）＞Cd（0.32mg kg-1）＞Pb（0.26 mg kg-1），其中Cu的生物利用度為0.61~0.70，平均值為0.65；As元素為0.41~0.53，平均值為0.46；Cd元素為0.42~0.58，平均值為0.49；Hg為0.40~0.43，平均值為0.41；Pb元素為0.51~0.53，平均值為0.52。模擬人工胃液中各重金屬的生物利用度大于其在模擬人工腸液中，表明重金屬在胃液中較易溶出而在腸液中溶出較少。同一重金屬在不同批次樣品中生物利用度有一定的差異，可能和培元通腦膠囊中重金屬的總量及存在的形態有關。

根據培元通腦膠囊（0.6 g 27粒）說明書，用法用量為每次3粒，每日3次，計算每日用量中含有Cu元素總量15.23g，生物可給量9.83g；As元素總量36.72g，生物可給量16.79g；Cd元素總量3.56g，生物可給量1.73g；Hg元素總量46.00g，生物可給量18.85g；Pb元素總量2.65g，生物可給量1.40g。參照FAO/WHO（JECFA）推薦的有害元素限量標準[15]，日劑量總量Hg元素超標，而生物可給量各元素均符合規定，說明培元通腦膠囊經過人工胃液和腸液模擬體內消化環境進行處理后，重金屬生物可給量明顯下降，遠低于藥物總重金屬含量，5種重金屬元素生物可給量均處于安全范圍內，因此不能單純以制劑中總重金屬量作為評價中成藥的毒性限度指標。

3.6 重金屬風險評估

根據公式（1）計算THQ，求和值為HI，結果見表5。HI＜1，說明培元通腦膠囊中重金屬對接觸人群健康影響不明顯。此外，HI生物可給量＜HI總量，表明用生物可給量評估重金屬對人體危害小于以總重金屬計。

表5 培元通腦膠囊的風險評估Table 5 The risk assessment of Peiyuan Tongnao Capsules

3.7 優勢與不足

目前對中藥重金屬生物利用度研究較少，經過查閱文獻，有學者做了野生青蒿[2]和柴胡飲片[12]的重金屬生物利用度研究，但目前還沒有中成藥制劑生物利用度研究的報道。作者研究化風丹中5種常見金屬的含量時發現，化風丹處方中含有朱砂和雄黃，Hg元素和As元素分別為其主要成分，故含量測定時日劑量Pb元素少量超標，Hg元素、As元素超標較多[1]。經過研究培元通腦膠囊的生物利用度測定結果，考慮化風丹中測得的Pb元素、Hg元素、As元素含量也未必是人體吸收含量。陳勇[16]研究發現化風丹治療腦卒中療效顯著，不良反應少，考慮其中重金屬元素含量在有效治療范圍，且不會引起毒性反應。李燕梅等[10]和孟憲舉等[11]研究發現，培元通腦膠囊療效顯著，可明顯改善患者癥狀，且不良反應少，考慮其吸收含量可達到有效治療范圍。

本實驗方法存在一定的局限性，在后續的實驗中我們會采用動物實驗進行驗證，以便對中藥制劑中重金屬含量和其潛在毒性之間的相關性進行準確評估。另外，本實驗由于所選樣品為心腦血管疾病所用藥品，兒童用藥幾率較少，故未對兒童進行重金屬風險評估。

4 結論

培元通腦膠囊在臨床使用量較大，2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）未規定其限量標準，為提高安全性，有必要對其中重金屬含量進行測定。本實驗以ICP-MS法建立了一種迅速有效、專屬性強的分析方法同時測定培元通腦膠囊中Cu、As、Cd、Hg和Pb的含量及這5種元素在人工胃液和腸液中的溶出情況，構建了體外消化模型，應用目標危害熵值法評估培元通腦膠囊中的重金屬污染水平及人群的接觸風險，結果表明，培元通腦膠囊中人體吸收重金屬含量均處于安全范圍內。本實驗可為培元通腦膠囊質量控制提供依據，對其他中成藥重金屬生物利用度研究及風險評估提供參考。