木姜葉柯葉黃酮類化學(xué)成分研究

魏文文，劉振昌，溫應(yīng)寧

（1.中國科學(xué)院華南植物園，中國科學(xué)院植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點實驗室，廣東 廣州 510650；2.惠州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，生物技術(shù)研究室，廣東 惠州 516023）

木姜葉柯葉[Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun]稱甜茶，系殼斗科柯屬常綠植物，是一種藥、食兩用的珍貴植物[1]。木姜葉柯葉甘甜清爽，不僅具有很好的藥理保健功能，而且還有“二抗雙降”（抗氧化、抗癌變、降血糖、降血脂）的作用[2-5]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，木姜葉柯葉的黃酮類化合物是其主要成分和功能性物質(zhì)[2,4]，目前對木姜葉柯葉的黃酮類化合物尚未進(jìn)行深入地研究，故選取木姜葉柯葉作為研究材料，對其進(jìn)行分離研究，以促進(jìn)其資源的開發(fā)利用。

1 材料儀器

柱層析用硅膠（青島海洋化工有限公司）；柱層析反相硅膠Develosil ODS（粒徑75m，日本富士化學(xué)公司）；Sephadex LH-20（瑞典Amersham Biosciences公司）；柱層析用MC（I德國Merck公司）；薄層層析板TLC（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；反相（RP-18）TLC板（德國Merck公司）；ESI-MS（美國Applied Bio-systems公司）；1H NMR和13C NMR（Bruker DRX-500型，瑞士Bruker公司）；半制備HPLC（日本Shimadzu公司）；所用試劑為分析純或色譜純。

木姜葉柯葉于2013年3月采自廣東省惠州市羅浮山，由中國科學(xué)院華南植物園刑福武研究員鑒定，晾干后粉碎備用。

2 提取分離

木姜葉柯葉干粉2.77 kg，用95%的乙醇室溫浸泡提取4次，每次48 h，減壓濃縮得乙醇浸膏0.97 kg，乙醇提取物用20%的乙醇沉淀過夜，離心，得到沉淀（259 g）和上清液（463 g）兩部分。沉淀經(jīng)正相硅膠柱層析（柱長1.2 m，內(nèi)徑10 cm，載樣量518 g），以三氯甲烷-甲醇梯度洗脫，收集流份，TLC檢查后合并為15個組分（St-1~St-15）。

St-8（5.5 g）經(jīng)反相硅膠柱層析，以甲醇-水（10:90~90:10,v/v）洗脫，經(jīng)TLC檢查，合并相同組分，共得到11個亞組分（St-8-a~St-8-k）。St-8-d經(jīng)葡聚糖凝膠，以甲醇洗脫，TLC檢查后合并得到3個亞組分（St-8-d-1~St-8-d-3），從St-8-d-2中得到化合物3（5 mg）和4（4 mg）。St-8-e經(jīng)葡聚糖凝膠，以甲醇洗脫，TLC檢查后合并得到4個亞組分（St-8-e-1~St-8-e-4），St-8-e-3經(jīng)正相硅膠（95:5,v/v），得到化合物2（4 mg）。St-9（5.5 g）經(jīng)反相硅膠柱層析，以甲醇-水（50:50~90:10,v/v）洗脫，經(jīng)TLC檢查，合并相同組分，共得到15個亞組分（St-9-a~St-9-o）。St-9-c經(jīng)HPLC制備以甲醇-水（45:55,v/v）作為流動相，流速10 mL min-1，分離得到化合物8（tR 87 min,10 mg）。St-10-g經(jīng)葡聚糖凝膠，以甲醇洗脫，TLC檢查后合并得到4個亞組分（St-10-g-1~St-10-g-4），St-10-g-2經(jīng)TLC檢查為一純物質(zhì)，得到化合物5（8 mg）。St-12經(jīng)正相硅膠柱層析，以三氯甲烷-甲醇（10:0~7:3,v/v）梯度洗脫，收集流份，TLC檢查后合并為10個亞組分（St-12-a~St-12-j）。St12-g（3.6g）經(jīng)反相硅膠柱層析，以甲醇-水（40:60~80:20,v/v）洗脫，經(jīng)TLC檢查，合并相同組分，共得到14個亞組分（St-12-g-1~St-12-g-14）。St-12-g-5經(jīng)葡聚糖凝膠，以甲醇洗脫，TLC檢查后合并得到4個亞組分（St-12-g-5-a~St-12-g-5-d），St-12-g-5-d經(jīng)正相硅膠（85:15,v/v），得到化合物9（7 mg）。St-12-g-5-c經(jīng)HPLC制備以甲醇-水（45:55,v/v）作為流動相，流速5 mL min-1，分離得到化合物6（tR 62 min,5 mg）。St-12-g-8-d經(jīng)HPLC制備以甲醇-水（47:53,v/v）作為流動相，流速5 mL min-1，分離得到化合物7（tR 96 min,2 mg）。St-12-g-7經(jīng)葡聚糖凝膠，以甲醇洗脫，TLC檢查后合并得到3個亞組分（St-12-g-7-a~St-12-g-7-c），St-12-g-7-b經(jīng)HPLC制備以甲醇-水（47:53,v/v）作為流動相，流速5 mL min-1，分離得到化合物1（tR 59 min,10 mg）。St-12-g-11經(jīng)葡聚糖凝膠，以甲醇洗脫，TLC檢查后合并得到4個亞組分（St-12-g-11-a~St-12-g-11-d），St12-g-11-d經(jīng)檢測為一純物質(zhì)，得到化合物10（6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 479[M+H]+,501[M+Na]+,477[M H],955[2M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) 7.03(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.64(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-5),6.10(1H,d,J=1.8 Hz,H-3'),5.93(1H,d,J=1.8 Hz,H-5'),3.34(2H,m,H-),2.77(2H,t,J=7.4 Hz,H-),4.97(1H,d,J=7.3 Hz,H-1''),3.34(4H,m,H-2'',H-3'',H-4'',H-5''),4.30(1H,dd,J=11.8Hz,1.7 Hz,H-6''),4.10(1H,dd,J=11.9Hz,6.7 Hz,H-6''),1.99(3H,s,-CH3CO);13C NMR(125MHz,DM50-d6) 131.5(C-1),129.1(C-2,C-6),115.0(C-3,C-5),155.3(C-4),204.5(C=O),105.0(C-1'),160.5(C-2'),94.0(C-3'),164.9(C-4'),97.0(C-5'),165.3(C-6'),44.9(C-),29.0(C-),100.6(C-1''),73.1(C-2''),76.4(C-3''),69.7(C-4''),73.9(C-5''),63.2(C-6''),170.2(-CO),20.6(-CH3).對照文獻(xiàn)[6]數(shù)據(jù)，確定化合物為2'-O-(6-O-乙酰葡萄糖苷)-4,4',6'-三羥基二氫查耳酮。

化合物2 淡黃色針晶，ESI-MS m/z 285[M+H]+,307[M+Na]+,591[2M+Na]+,283[M H],567[M H],603[2M+Cl];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)6.84(1H,s,H-3),12.89(1H,s,5-OH),6.19(1H,d,J=1.9 Hz,H-6),6.49(1H,d,J=1.9 Hz,H-8),3.83(3H,s,4'-OCH3),8.01(2H,d,J=8.9 Hz,H-2',H-6'),7.08(2H,d,J=8.9 Hz,H-3',H-5'),13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)163.3(C-2),103.6(C-3),181.8(C-4),157.4(C-5),98.9(C-6),164.3(C-7),94.1(C-8),161.4(C-9),103.8(C-10),122.9(C-1'),128.3(C-2',C-6'),114.6(C-3',C-5'),162.3(C-4'),55.6(-OCH3).對照文獻(xiàn)[7]數(shù)據(jù)，確定化合物為5,7-二羥基-4'-甲氧基黃酮。

化合物3淡黃色粉末，1HNMR(500MHz,MeOD)6.98(1H,s,H-3),6.20(2H,m,H-6),6.55(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),3.88(6H,s,-OCH3);13C NMR(125 MHz,MeOD) 163.7(C-2),102.2(C-3),181.8(C-4),161.4(C-5),98.9(C-6),164.3(C-7),94.2(C-8),157.9(C-9),103.7(C-10),125.9(C-1'),104.2(C-2'),148.2(C-3'),139.7(C-4'),148.2(C-5'),104.2(C-6'),56.4(-OCH3).對照文獻(xiàn)[8]數(shù)據(jù)，確定化合物為4',5,7-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮。

化合物4 淡黃色粉末，1H NMR (500MHz,MeOD) 6.90(1H,s,H-3),6.20(2H,m,H-6),6.47(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),3.75(6H,s,-OCH3);13C NMR(125 MHz,MeOD) 163.2(C-2),103.6(C-3),181.8(C-4),161.5(C-5),99.0(C-6),164.6(C-7),94.1(C-8),157.9(C-9),103.8(C-10),120.4(C-1'),107.7(C-2'),153.6(C-3'),139.9(C-4'),150.9(C-5'),104.7(C-6'),56.2(-OCH3).對照文獻(xiàn)[8]數(shù)據(jù)，確定化合物分別為3',5,7-三羥基-4',5'-二甲氧基黃酮。

化合物5 淡黃色針晶，ESI-MS m/z 271[M+H]+,293[M+Na]+,283[M H],269[M H],539[2M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)6.77(1H,s,H-3),12.96(1H,s,5-OH),6.18(1H,d,J=1.9 Hz,H-6),6.47(1H,d,J=1.9 Hz,H-8),7.92(2H,d,J=8.9 Hz,H-2',H-6'),6.92(2H,d,J=8.9 Hz,H-3',5');13CNMR(125 MHz,DMSO-d6) 163.8(C-2),102.8(C-3),181.8(C-4),157.3(C-5),98.9(C-6),164.3(C-7),94.0(C-8),161.2(C-9),103.7(C-10),121.2(C-1'),128.5(C-2',C-6'),116.0(C-3',C-5'),161.5(C-4').對照文獻(xiàn)[7]數(shù)據(jù)，確定化合物為4',5,7-三羥基黃酮。

化合物6 黃色無定形粉末，ESI-MS m/z 455[M+Na]+,471[M+K]+,887[2M+Na]+,431[M H],863[2M H];1HNMR(500 MHz,DMSO-d6)6.19(1H,d,J=1.8 Hz,H-6),6.47(1H,d,J=1.8 Hz,H-8),7.74(2H,d,J=8.7 Hz,H-2',H-6'),6.91(2H,d,J=8.7 Hz,H-3',H-5'),5.29(1H,d,J=1.0 Hz,H-1''),0.79(3H,d,J=6.0 Hz,H-6'');13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) 156.6(C-2),134.2(C-3),177.7(C-4),161.2(C-5),98.9(C-6),164.9(C-7),93.9(C-8),157.2(C-9),103.9(C-10),120.5(C-1'),130.6(C-2',6'),115.4(C-3',C-5'),160.0(C-4'),101.8(C-1''),70.3(C-2''),70.6(C-3''),71.7(C-4''),70.1(C-5''),17.6(C-6'').對照文獻(xiàn)[9]數(shù)據(jù)，確定化合物為阿福豆苷。

化合物7 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 595[M+H]+,618[M+Na]+,1211[2M+Na]+,593[M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) 7.95(2H,d,J=8.7 Hz,H-2',H-6'),6.82(2H,d,J=8.7 Hz,H-3',H-5'),5.36(1H,d,J=7.6 Hz,H-1''),3.17-3.30(4H,m,H-2'',H-3'',H-4'',H-5''),4.28(1H,d,J=10.9 Hz,H-6''),4.02(1H,dd,J=12.0 Hz,6.4 Hz,H-6''),7.39(2H,d,J=8.5 Hz,H-2''',H-6'''),6.79(2H,d,J=8.5 Hz,H-3''',H-5'''),7.37(1H,d,J=15.7 Hz,H-7'''),6.15(1H,d,J=18.0 Hz,H-8''').對照文獻(xiàn)[10]數(shù)據(jù)，確定化合物為山柰酚-3-O--d-(6″-p-香豆酰)-吡喃葡萄糖苷。

化合物8 黃色無定形粉末，ESI-MS m/z 295[M+Na]+,271[M H],543[2M H];1HNMR(500 MHz,MeOD) 5.34(1H,dd,J=12.9 Hz,2.8 Hz,H-2),3.11(1H,dd,J=17.1 Hz,13.0 Hz,H-3),2.70(1H,dd,J=17.1 Hz,3.0 Hz,H-3),5.89(2H,dd,J=6.9 Hz,2.1 Hz,H-6,H-8),7.31(2H,d,J=8.5 Hz,H-2',H-6'),6.82(2H,d,J=8.5 Hz,H-3',H-5');13C NMR(125 MHz,MeOD)80.5(C-2),44.0(C-3),197.8(C-4),165.5(C-5),97.0(C-6),168.4(C-7),96.2(C-8),164.9(C-9),103.3(C-10),131.1(C-1'),129.0(C-2',C-6'),116.3(C-3',C-5'),159.0(C-4').對照文獻(xiàn)[11]數(shù)據(jù)，確定化合物為柚皮素。

化合物9 黃色無定形粉末，ESI-MSm/z 287[M H],323[M+Cl],575[2M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) 5.37(1H,dd,J=12.5 Hz,3.0 Hz,H-2),3.20(1H,m,H-3),2.68(1H,dd,J=17.1 Hz,3.0 Hz,H-3),5.89(2H,s,H-6,H-8),6.75(2H,s,H-2',H-6'),6.88(1H,s,H-4');13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) 78.5(C-2),42.1(C-3),196.3(C-4),162.9(C-5),95.8(C-6),166.9(C-7),95.0(C-8),163.5(C-9),101.7(C-10),129.5(C-1'),114.4(C-2'),145.2(C-3'),145.7(C-4'),115.4(C-5'),117.9(C-6').對照文獻(xiàn)[12]數(shù)據(jù)，確定化合物為3',5,5',7-四羥基黃酮烷。

化合物10 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 763[M+Na]+,739[M H],1479[2M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) 6.12(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.37(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),7.98(2H,d,J=8.9 Hz,H-2',H-6'),6.88(2H,d,J=8.9 Hz,H-3',H-5'),5.71(1H,d,J=8.1 Hz,H-1''),4.92(1H,m,H-2''),4.30(1H,d,J=10.2 Hz,H-6''),7.39(2H,d,J=8.7 Hz,H-2''',H-6'''),6.86(2H,d,J=8.7 Hz,H-3''',5'''),7.36(1H,d,J=15.8 Hz,H-7'''),6.13(1H,d,J=15.8 Hz,H-8'''),7.57(2H,d,J=8.7 Hz,H-2'''',H-6''''),6.80(2H,d,J=8.7 Hz,H-3'''',H-5''''),7.61(1H,d,J=15.8 Hz,H-7'''');13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)156.3(C-2),132.5(C-3),170.0(C-4),161.1(C-5),98.9(C-6),165.3(C-7),93.7(C-8),156.2(C-9),103.7(C-10),120.6(C-1'),132.7(C-2',C-6'),115.2(C-3',C-5'),160.1(C-4'),98.2(C-1''),73.8(C-2''),73.7(C-3''),70.2(C-4''),74.3(C-5''),62.7(C-6''),124.9(C-1'''),130.2(C-2''',C-6'''),115.4(C-3''',C-5'''),158.8(C-4'''),143.2(C-7'''),113.5(C-8'''),166.1(C-9'''),125.4(C-1''''),130.8(C-2'''',C-6''''),115.8(C-3'''',C-5''''),159.9(C-4''''),144.7(C-7''''),114.9(C-8''''),165.2(C-9'''').對照文獻(xiàn)[13]數(shù)據(jù)，確定化合物為山柰酚-3-O-[6",2"-di-O-(E)-p-香豆酰]--d-葡萄糖苷。10個黃酮化合物的和結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 10個黃酮化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formulas of ten flavone compounds

4 結(jié)論和討論

本試驗利用乙醇浸提、溶劑萃取、正反相硅膠柱及凝膠柱色譜層析等分離手段，從木姜葉柯葉中分離得到了10個化合物，通過光譜分析及與文獻(xiàn)比對，分別鑒定為2'-O-(6-O-乙酰葡萄糖苷)-4,4',6'-三羥基二氫查耳酮（1）、5,7-二羥基-4'-甲氧基黃酮（2）、4',5,7-三羥基-3',5'-二甲氧基黃酮（3）、3',5,7-三羥基-4',5'-二甲氧基黃酮（4）、4',5,7-三羥基黃酮（5）、阿福豆苷（6）、山柰酚-3-O--d-(6″-p-香豆酰)吡喃葡萄糖苷（7）、柚皮素（8）、3',5,5',7-四羥基黃酮烷（9）、山柰酚-3-O-[6",2"-di-O-(E)-p-香豆酰]--d-葡萄糖苷（10），其中化合物1、7、10首次從該植物中分離得到。

本研究以木姜葉柯葉為原料，對其化學(xué)成分展開了系統(tǒng)分離與鑒定研究，結(jié)果表明黃酮和二氫查耳酮為木姜葉柯葉的主要化學(xué)成分，這對于推進(jìn)木姜葉柯的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用具有積極意義。