UPLC-Q/TOF-MS結(jié)合UNIFI庫快速分析西洋參莖葉三醇皂苷

史大臻，賴思含，劉俊彤，付東興，譚璐瑩，王彩霞，周柏松，李平亞，吳福林

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021）

西洋參（Panax quiquefolium L.）又稱花旗參，屬五加科人參屬植物，是一種名貴的植物藥材，其根為西洋參的傳統(tǒng)藥用部位。近年來，有研究[1-3]發(fā)現(xiàn)西洋參的上部分，特別是其莖葉作為新的藥用部位，具有重要的藥用價值。西洋參莖葉中主要活性成分為皂苷類成分，西洋參莖葉總皂苷具有增強(qiáng)心血管系統(tǒng)功能[4]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)[5]、抗炎[6]和抗氧化[7]等重要藥理作用，其中，三醇皂苷：人參皂苷Re、-Rg2、-Rg1、-Rh1和-PPT，偽人參皂苷PF11、-RT5；奧克梯隆也具有抗癌[8]、降血糖[9]、肝保護(hù)[10]和抗胃潰瘍[11]等生物活性。曹霞和田剛等[12,13]人研究表明，西洋參莖葉三醇皂苷可通過降低血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH），丙二醛（MDA）含量及提高超氧化歧化酶（SOD）活性，來減小心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死范圍（MIS），發(fā)揮心血管系統(tǒng)保護(hù)作用。同屬植物三七的三醇皂苷已被開發(fā)為具有活血化瘀功能的二類中藥三七通舒膠囊[14]。綜上，可以推斷西洋參莖葉三醇皂苷具有潛在的藥用價值，本課題組前期已從總皂苷中高效制備了三醇皂苷，并獲得國家授權(quán)發(fā)明專利（CN98100070.3）[15]，成功分離并鑒定了9個三醇皂苷[16]。

超高效液相色譜與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLCQ/TOF-MS）具有靈敏、分辨率高和分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為天然藥物中活性成分分離與鑒定的重要手段。UNIFI天然產(chǎn)物分析數(shù)據(jù)庫包括從600余種中藥中發(fā)現(xiàn)的6 000多種化合物信息，能將數(shù)據(jù)采集、分子式確定、峰提取、數(shù)據(jù)庫檢索及報告生成相結(jié)合，以此對化學(xué)成分進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地定性分析[17,18]。近年來，本課題組利用UPLC-Q/TOF-MS與UNIFI數(shù)據(jù)平臺相結(jié)合，快速分析鑒定出了人參、西洋參、桔梗和辣木葉等的化學(xué)成分[18-20]。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)分析平臺，對西洋參莖葉三醇皂苷化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面地分析與鑒定，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制提供依據(jù)，同時也為后續(xù)針對西洋參莖葉三醇皂苷的藥物開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與裝置

Xevo G2-XS型Q-TOF四級桿飛行時間質(zhì)譜儀、AC-QUITY UPLC二元泵和樣品管理器、UNIFI科學(xué)信息學(xué)系統(tǒng)V1.7（美國Waters公司）、TGL-16aR型飛鴿超速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、R501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）、FA1104N型電子天平（上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

西洋參莖葉三醇皂苷，實(shí)驗(yàn)室自制，淡黃色粉末（總皂苷含量80%）。人參皂苷Re、-Rg2、-Rg1、-Rh1、-Rf、-F1，擬人參皂苷RT5、-F11、奧克梯隆對照品，均購自中國藥品生物制品鑒定所。乙腈（美國Fisher公司，色譜級）；甲酸鈉、亮氨酸-腦啡肽（美國Sigma公司，色譜級）；水為屈臣氏純凈水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備

取西洋參莖葉三醇皂苷適量，用80%甲醇1 mL溶解，制成濃度約為0.05 mg/mL的供試品溶液，過濾（0.22m膜），備用。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱定對照品人參皂苷Re、-Rh1、-Rg2、-Rg1、-Rf、-F1，擬人參皂苷F11、-RT5、奧克梯隆適量，加入甲醇溶解，定容至100 mL，制備成濃度約為2.0 mg/mL（最高2.8 mg/mL，最低1.1 mg/mL）的混合對照品溶液，備用。

2.3 檢測條件

2.3.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm 2.1 mm，1.7m）；柱溫30℃；樣品管理器溫度15℃；進(jìn)樣體積10L；流速0.4 mL/min；流動相：0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)；洗脫梯度：0~2 min，10%B；2~26 min，10%→90%B；26~28 min，90%B；28~29 min，90%→10%B；29~30 min，10%B。

2.3.2 質(zhì)譜條件 Xevo G2-XS Q-TOF質(zhì)譜儀，電噴霧電離源（ESI），源溫度120℃；去溶劑化溫度300℃；毛細(xì)管電壓2.6 kV（ESI+）或2.2 kV（ESI）；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣流量800.0 L/h；錐孔氣流量50 L/h。在MSE模式下，低能通道和高能通道能量分別設(shè)置為6 V和20~40 V；質(zhì)譜儀用100~1 500 Da的甲酸鈉校準(zhǔn)；所使用的實(shí)時校正液亮氨酸-腦啡肽（m/z 556.2771[M+H]+，m/z 554.2615[M-H]﹣）為實(shí)時校正標(biāo)準(zhǔn)液（Lock SprayTM，100 ng/mL，15L/min），使用MasslynxTMV4.1工作站以MSEcontinuum模式采集數(shù)據(jù)。

2.4 數(shù)據(jù)采集與處理

首先，查閱有關(guān)西洋參皂苷類化學(xué)成分的相關(guān)文獻(xiàn)報道，匯總化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式，并以mol.文件格式導(dǎo)入UNIFI分析平臺中，作為UNIFI分析平臺自帶的傳統(tǒng)中藥數(shù)據(jù)庫的補(bǔ)充；其次，將LC-MS原始數(shù)據(jù)以Waters Compression and Archival Tool v1.10軟件進(jìn)行壓縮；第三，應(yīng)用UNIFI數(shù)據(jù)庫軟件自動篩查、鑒定化合物，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工提峰、計(jì)算分子式以及分析碎片斷裂情況；第四，創(chuàng)建過濾篩選方法，即設(shè)定質(zhì)量誤差為5 mg/kg，且響應(yīng)值大于3 000；最后，通過結(jié)合碎片離子理論精確質(zhì)量數(shù)、相對保留時間和分子式匹配軟件Elemental composition、化合物結(jié)構(gòu)匹配軟件MassFragment、離線及在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（PubMed,Mass Bank,Chemspider,METLIN）及相關(guān)文獻(xiàn)對各主要化合物進(jìn)行人工識別和確認(rèn)。

3 結(jié)果

在西洋參莖葉三醇中共檢測到31個三萜皂苷類成分，其中20位碳側(cè)鏈未發(fā)生變化的21種，20位碳側(cè)鏈發(fā)生變化的10種。ESI+、ESI模式下的質(zhì)譜基峰離子流圖見圖1。化合物鑒定結(jié)果見表1。由西洋參莖葉三醇中鑒定出皂苷類化合物結(jié)構(gòu)圖見圖2。

圖1 PQTS在ESI+、ESI模式下的基峰離子流圖Fig.1 The base peak ion chromatograms of PQTS in ESI+and ESI

圖2 PQTS中鑒定出的皂苷類化合物結(jié)構(gòu)式Fig.2 The structural formulas of saponins identified in PQTS

表1 PQTS中皂苷類成分的UPLC-Q-TOF/MS鑒定結(jié)果Table 1 The UPLC-Q-TOF/MS identification results of saponins in PQTS

續(xù)表1

續(xù)表1

3.1 20位碳側(cè)鏈發(fā)生變化的三醇皂苷鑒定

20位碳側(cè)鏈發(fā)生變化的三醇皂苷多為奧克梯隆型皂苷，奧克梯隆型三萜皂苷（元）是西洋參相比于人參特有成分[21]，也是西洋參莖葉三醇中的標(biāo)志性成分。根據(jù)文獻(xiàn)報道，奧克梯隆型三萜皂苷具有神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)[22]，提高心血管系統(tǒng)功能[23]、抗癌[24]、治療胃潰瘍[25]等多種藥理活性，是西洋參莖葉三醇發(fā)揮抗心肌缺血作用的重要活性成分。基于UNIFI數(shù)據(jù)庫分析的裂解碎片信息，結(jié)合對照品對比及化合物相關(guān)參考文獻(xiàn)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比的方法，鑒定出奧克梯隆型三萜皂苷（元）9個，其他構(gòu)型皂苷1個。下面以化合物14和16為例，解析其鑒定過程。

（1）化合物14：在ESI模式下，化合物14的保留時間為9.52 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z 845.528 8[M+HCOO]，799.518 1[M H]，主要產(chǎn)生1個碎片離子，即653.453 9[M H-Rha]，與偽人參皂苷F11對照品基本一致，再結(jié)合文獻(xiàn)報道[26]，可將其鑒定為偽人參皂苷F11。偽人參皂苷F11對照品與化合物18的MS/MS圖見圖3。

（2）化合物16：在ESI模式下，化合物16的保留時間為9.80 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z 699.493 4[M+HCOO]主要產(chǎn)生2個碎片離子，即m/z 635.473 0[M H-H2O]、m/z 491.412 3[M H-Glu]，與偽人參皂苷RT5對照品的碎片離子基本一致，再結(jié)合文獻(xiàn)[27]報道，可將其鑒定為偽人參皂苷RT5。偽人參皂苷RT5對照品與化合物16的MS/MS圖見圖4。

圖4 ESI模式擬人參皂苷RT5與化合物16的MS/MS圖Fig.4 The MS/MS spectra of pseudo-ginsenoside RT5 and compound 16 in the ESI mode

3.2 20位碳側(cè)鏈發(fā)生未變化的三醇皂苷鑒定

20位碳側(cè)鏈發(fā)生未變化的三醇皂苷鑒定為原人參三醇皂苷（元），原人參三醇皂苷（元）是西洋參莖葉三醇中的主要成分，也是本次鑒定的重點(diǎn)。在ESI模式下，鑒定出原人參三醇三萜皂苷20個，在ESI+模式下，鑒定出原人參三醇三萜皂苷1個。以化合物11與化合物23為例，解析鑒定過程。

（1）化合物11保留時間為8.96 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z 683.501 4[M+HCOO]，與人參皂苷對照品F1基本一致，再結(jié)合文獻(xiàn)報道[28]可將其鑒定為人參皂苷F1。人參皂苷F1對照品與化合物11的MS/MS圖見圖5。

圖5 ESI模式人參皂苷F1對照品與化合物11的MS/MS圖Fig.5 The MS/MS spectra of ginsenoside F1 and compound 11 in the ESI mode

（2）化合物23保留時間為11.08 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z 637.457 3[M H]，主要產(chǎn)生1個碎片離子，即m/z 475.395 4[M H-Glu]，再結(jié)合文獻(xiàn)[29]報道，鑒定為人參皂苷Rh1。化合物23的MS/MS圖見圖6。

圖6 ESI模式人參皂苷Rh1對照品與化合物23的MS/MS圖Fig.6 The MS/MS spectra of ginsenoside Rh1 and compound 23 in the ESI mode

4 討論

近年來，心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的健康[30]。前期研究表明[12,13]，西洋參莖葉三醇對心肌缺血再灌注及急性心肌梗死具有良好的保護(hù)作用。三萜皂苷類化合物是西洋參莖葉中主要活性成分，以往研究通過柱層析、核磁共振等方法對西洋參莖葉三醇皂苷中含量較高的成分如人參皂苷Re、Rg1和Rh1等進(jìn)行了分離鑒定[16]，但對西洋參莖葉三醇皂苷的全面分析未見報道。本研究首次運(yùn)用UPLCQ/TOF-MS技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)分析平臺定性分析了西洋參莖葉三醇皂苷中的化學(xué)成分，從中鑒定出三萜皂苷類化合物31個，其中20位碳側(cè)鏈發(fā)生變化的10個，20位碳側(cè)鏈未發(fā)生變化的11個。

本研究利用飛行時間質(zhì)譜高靈敏度的優(yōu)勢，對西洋參莖葉三醇皂苷中的微量成分，如人參皂苷F3、-Rf和偽人參皂苷RT5等也加以鑒定。研究表明，這些皂苷也具有抗炎[31]、神經(jīng)保護(hù)[32]等生物活性，因此，除西洋參莖葉三醇皂苷中含量較高的成分外，這些微量成分發(fā)揮的藥理作用也不容忽視。總之，本文可為西洋參莖葉三醇皂苷藥物的開發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。