人參杞黃顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定

李素凱，劉露，劉夢燕，李萍，陳笑宇，李冬冬，楊錦竹※，王偉

（1.吉林大學，吉林 長春 130012;2.吉林省食品檢驗所，吉林 長春 130012）

人參杞黃顆粒是以黃芪、人參和枸杞經提取、濃縮、干燥得到的干膏粉碎后與糊精、甜蜜素和糖精鈉等輔料混合、以88%的乙醇制粒而得到的中藥制劑。黃芪為豆科植物膜莢黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch）Bge.]或蒙古黃芪[Astragalusmembranaceus（Fisch）Bge.Var.mongholicus（BgRe.）Hsio]的干燥根[1]。黃芪氣微，味微甜，性微溫，具有提高免疫、益氣保肝、托瘡利尿、減緩衰老、抗應激及抗菌等廣泛作用。可食用可藥用，用于臨床和保健食品的研制。黃芪含有皂甙類、多糖類和黃酮類等多種化學成分[2]，研究表明，黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪的活性指標成分，有相關研究也報道了毛蕊異黃酮苷的含量測定方法[3-8]，將毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為指標去評價黃芪的文獻近400篇，通過閱讀就會發現藥典中黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法對黃芪藥材的含量測定效果較好，但是涉及到成分復雜的中藥制劑往往就不能夠達到想要的效果，而且目前約15%臨床使用的方劑中均含有黃芪，且多作為君藥使用[9]。如果使用藥典中的測定方法，由于毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰時間太早（約11 min），分離效果差，那么大多數復方中黃芪的質量標準是沒辦法制定的，所以在此情況下會通過改變色譜條件以控制質量標準，目前我們常見的中藥制劑均采用企業自擬標準，而且至今也尚未形成國家統一的質量標準[10,11]。為了有效控制和評價人參杞黃顆粒的質量，我們通過改善藥典中黃芪的供試品處理方法和加大甲酸比例、加長流動相大極性段洗脫時間等方法到達分離目的，從而建立人參杞黃顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器設備

Acchrom S3000型高效液相色譜儀（華譜科技有限公司）；Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m）色譜柱（蘇州賽分科技有限公司）；KQ-250DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限責任公司）；Sartorius BT 25s電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.2 試劑與材料

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號111920-201606，中國食品藥品檢定研究院）；人參杞黃顆粒為實驗室自制（人參、黃芪、枸杞子按1:1.72:1.84比例配比，輔料為糊精、甜蜜素、糖精鈉。顆粒劑規格為8 g/袋，食用方法為每日1次，1袋/次）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；甲酸（色譜純，天津市光復精細化工研究所）；水為試驗室雙蒸水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜填充柱：Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m），流動相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A）；檢測波長：260 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：20L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品1 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

2.3.1 藥典色譜條件 參考藥典“黃芪”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的色譜條件[12]。以Amethyst C18-H柱（4.6 mm 250 mm，5m）為色譜柱，乙腈為流動相A，0.2%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0~20 min，20%→40%A；20~30 min，40%A）；流速為1 mL/min；柱溫為25℃；進樣量為20L，進行測定，得到結果見圖1。

2.2.3 黃芪陰性對照溶液的制備 取除黃芪以外的兩種藥材進行提取干燥與輔料進行制粒，將所得產品按“2.2.2”中方法進行處理，得到陰性對照溶液。

2.3 優化毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定色譜條件

2.2.2 供試品溶液的制備 取人參杞黃顆粒，磨成粉，過四號篩，精密稱定7 g，加入到圓底燒瓶中，量取甲醇50 mL加入并進行稱定，放置于水浴鍋中加熱回流4 h，放冷，再進行稱定，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，回收溶劑至干，得供試品殘渣，備用；將少量脫脂棉放在內徑為15 mm層析柱的出口處，加入乙醇處理好的D101大孔樹脂適量，高度約為20 cm，用蒸餾水沖洗大孔樹脂，直至流出的液體不呈白色渾濁且無味為止，將上述供試品殘渣溶于10 mL蒸餾水中，完全轉移至層析柱上，用200 mL蒸餾水洗脫，棄去洗脫液，再用20%乙醇200 mL進行洗脫，棄去洗脫液，最后用70%乙醇200 mL進行洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，用甲醇定容到10 mL量瓶中即得。

圖1 藥典色譜條件下兩種樣品的HPLC圖Fig.1 The HPLC chromatograms of 2 kinds of samples under the pharmacopoeia chromatogram condition

2.4.5 重現性試驗 按照“2.2.2”項下供試品溶液制備的方法對6份同一批次人參杞黃顆粒的樣品進行處理，取各溶液20L，注入HPLC儀器中進行測定，記錄峰面積。結果表明，6份人參杞黃顆粒的平行樣中所含的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量平均值為2.562 mg/g，RSD為0.757 6%（n=6），說明該方法的重現性良好。

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圖2 色譜條件優化后和大孔樹脂洗脫后的供試品HPLC圖Fig.2 HPLC diagrams of test products after optimized chromatographic conditions and elution of macroporous resin

2.4 方法學考察

2.4.4 穩定性試驗 將同一份供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件在0、2、4、8、12、24 h時進樣，測定峰面積，得到RSD為1.340 9%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

圖3 人參杞黃顆粒中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的HPLC圖Fig.3 HPLC diagrams of Calycosin Glycoside in Renshen Qihuang Granules

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2.4.6 加樣回收試驗 精密稱取6份人參杞黃顆粒粉末，計算顆粒粉末中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，再將等量毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品加入到6份粉末中，按照“2.2.2”項下供試品溶液處理方法進行制備，計算各樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷實測值，計算平均回收率為99.26%，RSD為0.81%（n=6）（表1），表明該測定方法回收率良好。

2.4.2 線性關系考察 將“2.2.1”項下的對照品溶液用甲醇逐步稀釋，得到濃度分別為0.004mg/mL、0.008mg/mL、0.012 mg/mL、0.016 mg/mL、0.020 mg/mL及0.024 mg/mL的一系列毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液，依次進樣，記錄得到的峰面積并繪制標準曲線，毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為y=55201x-6.0087（r=0.9996），線性范圍為0.004~0.024 mg/mL，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在此濃度范圍內呈較好的線性關系。

2.4.1 專屬性考察 將“2.2”項下各個溶液通過微孔濾膜過濾后注入自動液相儀器中進行測定，得到色譜圖見圖3：

2.3.2 藥典色譜條件優化 經過查閱資料并進行多次試驗發現，當以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A），檢測波長為260nm，柱溫為25℃，流速為1.0mL/min的色譜條件時峰位置的前后色譜峰對其干擾小，但是其分離度未能達到要求。所以將供試品過大孔樹酯進行洗脫，除雜，使其分離度達到要求。兩種情況色譜圖見圖2。因此，確定該條件為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的優選色譜條件。

2.4.3 精密度試驗 將“2.2.2”項下的供試品溶液，按照時間順序連續進6次，每次進樣20L，記錄峰面積，求得峰面積的RSD值為0.7449%（n=6），表明儀器精密度良好。

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表1 加樣回收率試驗結果Table 1 The results of recovery tests

2.4.7 樣品含量測定 從3批人參杞黃顆粒中各取3個平行樣，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備的方法進行處理，分別吸取20L，注入HPLC儀器中進行測定，3個批次平行樣平均值分別為2.688 mg/100g、2.668 mg/100g、2.630 mg/100g。3批含量RSD值為1.494 7%。表明該品毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量穩定，均一性良好。

[36]Royal Government of Cambodia,“Political Platform of Royal Government of Cambodia of the Fifth Legislature of National Assembly”, https://www.cambodianembassy.org.uk/f_home/PDF/Political_Platform_Royal_Government_Cambodia_5th.pdf, 2013年9月。

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3 討論

在研究中，采用藥典方法得到的毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜峰基線不能分離，可能是由于中藥制劑的成分復雜，雜質干擾作用大[13]。通過多次實驗摸索，梯度洗脫為（0~50 min，12%A；50~80 min，12%~50%A），流速為1.0 mL/min時，能夠使出峰位置受到的干擾最小，但是由于前面的雜質太多使得毛蕊異黃酮葡萄糖苷的分離效果達不到預期，我們又進一步將供試品溶液通過大孔樹酯進行洗脫，處理得到新的供試品溶液，結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷與雜質峰能夠有效分離，分離度＞1.5，因此，確定該條件為毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定的優選色譜條件。后對其進行方法學驗證，發現該毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法專屬性較好，陰性無干擾，分離度能達到要求，重復性、精密度、穩定性和回收率等均符合要求，可用于人參杞黃顆粒的質量標準控制。

之后實驗遇到雜質成分過多的情況，可優先考慮改善前處理方法，再進行色譜條件優化，以減少摸索時間。此方法條件下毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰位置前后有一段范圍的無干擾區域，所以其他黃芪的中藥制劑可根據此方法通過增大和減小流速來使出峰位置合適，希望能對以后的實驗研究有所幫助。