紅花逍遙片HPLC指紋圖譜的研究

胡吉忠，張金良，蘭曉峰，饒毅，謝子文，劉厚權，陳廣云，夏淑英，康興東※

（1.江西普正制藥股份有限公司，江西 吉安 343100；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330006）

紅花逍遙片源于宋代《太平惠民和劑局方》中的中醫經典名方“逍遙散”，經云南彝族傳統醫籍《哀牢本草》改進而成，處方中包括當歸、竹葉柴胡、紅花、白芍、白術、茯苓、皂角刺、薄荷和甘草等藥材，具有舒肝、理氣和活血等功效[1]。紅花逍遙片在臨床上常用于治療月經后期、經前期綜合征、更年期綜合征、乳腺增生和黃褐斑等癥[2-6]。目前紅花逍遙片的質量控制主要是對芍藥苷、甘草苷、芍藥內酯苷、羥基紅花黃色素A及甘草酸等指標成分進行含量測定[7,8]，缺少對紅花逍遙片整體的質量控制。本實驗研究建立了紅花逍遙片的HPLC指紋圖譜方法，再通過產品整體性的相似度評價，對主要色譜峰來源進行歸屬[9,10]，提升了紅花逍遙片的整體質量評價和控制能力，為進一步保障產品質量提供了依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設備

Waters 2695-2998型高效液相色譜儀（美國沃特世公司，含四元泵、自動進樣器、檢測器）；AUW2200十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）；AB104-N萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；JK-300型超聲波清洗儀（合肥金尼克機械制造有限公司）。

1.2 試劑與試藥

芍藥苷對照品（批號：110736-201943）、甘草苷對照品（批號：111610-201607）、甘草酸銨對照品（批號：110731-201720）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純）和乙醚（分析純）購自西隴科學股份有限公司；甲醇（分析純）購自天津市恒興化學試劑有限公司；冰醋酸（分析純）購自天津市富宇精細化工有限公司；乙醇（分析純）購自天津市致遠化學試劑有限公司；水均是自制超純水。紅花逍遙片共10批（江西普正制藥有限公司，批號分別為180101、180302、180404、180502、180605、180701、181004、181103、190102和190303，規格：每片重0.39 g）。

當歸、竹葉柴胡、紅花、白芍、白術、茯苓、皂角刺、薄荷和甘草藥材均購自樟樹藥材市場，經江西普正制藥股份有限公司吳永忠研究員鑒定當歸為傘形科植物當歸[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根，白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，白術為菊科植物白術（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根莖，茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥菌核，紅花為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，皂角刺為豆科植物皂莢（Gleditsia sinensis Lam.）的干燥棘刺，薄荷為唇形科植物薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）的干燥地上部分，甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）的干燥根和根莖，竹葉柴胡為傘形科植物膜緣柴胡（Bup-leurum marginatum Wall．ex DC．）的干燥帶根全草。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱（250 mm 4.6 mm，5m）；以乙腈為流動相A，0.1%的冰醋酸為流動相B，梯度洗脫：0~10 min，12%~16%乙腈；10~25 min，16%~20%乙腈；25~30 min，20%~22%乙腈；30~40 min，22%~33%乙腈；40~50 min，33%~40%乙腈；50~60 min，40%~50%乙腈；60~70 min，50%~65%乙腈；進樣量10L；流速為1 mL/min，檢測波長為230 nm；柱溫25℃，理論板數按芍藥苷峰計算應不低于2 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取適量的甘草苷、甘草酸及芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 mL含50g對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取紅花逍遙片10片，除去薄膜衣，研細，取約0.35 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，超聲處理25 min，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45m微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 各單味藥材溶液制備 分別取當歸、竹葉柴胡、紅花、白芍、白術、茯苓、皂角刺、薄荷和甘草等9味藥材各約30 g，分別加入300 mL水浸泡40 min，加熱煮沸后，文火慢煎2 h，放冷，紗布濾過，第2次煎煮加入200 mL水，加熱煮沸后，文火慢煎2 h，紗布濾過，合并兩次煎液，濾液濃縮成至相對密度為1.40（50℃）的稠膏，干燥，粉碎，得干燥浸膏粉。按處方量分別稱取浸膏粉，精密稱定質量，按2.2.2供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法取紅花逍遙片樣品制備1份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定的指紋圖譜用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）分析，結果顯示，不同批次間相似度均值為0.996，說明該方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 按“2.2.2”項下供試品溶液制備的方法取紅花逍遙片樣品平行制備6份提取物溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，測定的指紋圖譜用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）分析，結果顯示，不同批次間相似度達到0.95以上，說明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法取紅花逍遙片樣品制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24h后按“2.1”項下色譜條件進樣，測定的指紋圖譜用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）分析，結果顯示，不同批次間共有峰相對保留時間的相對標準偏差為0~0.42%，相對峰面積的相對標準偏差為0~5.08%，相似度為0.996~1.000，表明本方法在24 h內穩定性良好。

2.4 紅花逍遙片HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 共有峰的確定 按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法取10批紅花逍遙片樣品制備樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，測定的10批指紋圖譜用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）分析，選取峰面積較大且分離度較好的10個色譜峰作為紅花逍遙片指紋圖譜共有特征峰。

2.4.2 相似度評價 將10批紅花逍遙片指紋圖譜用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）分析，以S1（批號180101）為參照圖譜，設定時間寬度為0.1 min，多點校正，中位法生成10批紅花逍遙片指紋圖譜共有模式圖（圖1），進而建立紅花逍遙片的對照指紋圖譜（圖2），相似度結果見表1。10批紅花逍遙片HPLC指紋圖譜相似度均在0.95以上，說明10批產品的批間質量穩定性良好。

表1 紅花逍遙片HPLC指紋圖譜相似度Table 1 The HPLC fingerprint similarity of Honghua Xiaoyao Tablets

圖1 10批紅花逍遙片指紋圖譜共有模式圖Fig.1 The common pattern of fingerprint spectrum for 10 batches of Honghua Xiaoyao Tablets

圖2 紅花逍遙片對照指紋圖譜Fig.2 The fingerprint spectrum of Honghua Xiaoyao Tablets

2.5 峰指認研究

紅花逍遙片供試品溶液和甘草苷、甘草酸、芍藥苷對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，測定的紅花逍遙片及對照品指紋圖譜用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）分析，結果見圖3，確認峰4、峰6和峰11分別為芍藥苷、甘草苷和甘草酸。

圖3 混合對照品及紅花逍遙片的供試品HPLC圖Fig.3 HPLC diagrams of the mixed reference substance and Honghua Xiaoyao Tablets

2.6 譜峰歸屬研究

將紅花逍遙片的各單味藥材溶液按“2.1”項下色譜條件進樣，測定的指紋圖譜與紅花逍遙片對照指紋圖譜疊加，各藥材的色譜峰與紅花逍遙片對照圖譜共有峰對應，表明藥材到紅花逍遙片產品的質量傳遞過程有良好的相關性和一致性，保留了主要化學成分。再進行色譜峰歸屬，將紅花逍遙片對照指紋圖譜中的共有峰追溯到各單味藥材，結果見圖4。試驗結果可得，峰1、峰5來自于竹葉柴胡藥材；峰3、峰4（S）來自于白芍藥材；峰6、峰8、峰11來自于甘草藥材；峰7來自于薄荷藥材；共有峰2來自于紅花、甘草藥材；共有峰9來自于甘草、薄荷藥材；共有峰10來自于甘草、白芍藥材；另外白術、當歸、茯苓與成品的HPLC共有峰未有明顯的峰歸屬關系。結果顯示紅花逍遙片與其組方藥材之間存在良好的相關性，較好地反映了產品質量，使產品質量具有較好的可追溯性。

圖4 紅花逍遙片峰歸屬Fig.4 Peak attributions of Honghua Xiaoyao Tablets

3 討論

本研究采用HPLC法建立紅花逍遙片的指紋圖譜，并對共有峰與藥材的相關性進行了研究，能簡便地鑒別部分藥材，使紅花逍遙片生產質量控制具有較好的可追溯性。