miR-27a-3p 在氧糖缺失-復氧復糖損傷PC12 細胞中的表達及其對PC12細胞增殖、凋亡的影響

李俊杰，彭麗佳，羅靖，熊莉，邵建林

昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科，昆明650000

缺血性腦卒中是目前常見和多發的神經系統疾病之一，有較高的致殘、致死率［1］。腦缺血發生后最有效的治療是通過溶栓或取栓，盡快恢復阻塞部位血管的再通，然而，腦血管再通、血流再灌注會引起某些部位缺血性腦組織的損傷或神經功能的進一步惡化，即發生腦缺血-再灌注損傷（CI-RI）［2］。CI-RI的機制較復雜，主要包括氧化應激、興奮性毒性、細胞內鈣離子超載等，而細胞凋亡被認為是再灌注損傷早期引起缺血區域神經細胞死亡的主要原因之一［3］。miRNAs是一種短鏈非編碼的小RNA，在各器官、組織和細胞中均有表達，存在于中樞神經系統中。在CI-RI 過程中，miRNAs是神經元存活的重要調節因子［4-5］。近年研究表明，miR-27a-3p在黑色素瘤［6］、卵巢癌［7］、骨關節炎［8］等疾病中有調節細胞增殖和凋亡作用。然而，有關miR-27a-3p在CI-RI中的相關研究鮮見報道。本研究擬應用氧糖缺失-復氧復糖（OGD/R）損傷的PC12細胞模型，體外模擬CI-RI病理狀態，觀察miR-27a-3p在OGD/R損傷的PC12細胞中表達，探討miR-27a-3p對OGD/R損傷PC12細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12 細胞細胞株購自中國科學院昆明動物研究所；DMEM高糖培養基購自美國HyClone公司；miR-27a-3p模擬物序列、miR-27a-3p模擬物陰性對照序列、miR-27a-3p 抑制劑序列和miR-27a-3p 抑制劑陰性對照序列由廣州復能基因有限公司合成；Ploybrene 慢病毒購自上海吉凱基因科技有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；MicroRNAs逆轉錄試劑盒和mRNA 逆轉錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；miR-27a-3p、Caspase-3、Bax、Bcl-2、U6 和β-actin 引物均由北京擎科生物科技有限公司合成；兔抗鼠Cleaved-Caspase-3抗體購自美國CST公司；兔抗鼠Bax、β-actin抗體購自美國Abcam公司；兔抗鼠Bcl-2 抗體購自美國GeneTex 公司；HRP 標記的山羊抗兔第二抗體購自美國Sigma公司；ECL化學發光顯影液購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；酶標儀購自美國BioTek 公司；CFX96 實時熒光定量PCR儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養和轉染 PC12 細胞用含10%FBS 的DMEM 高糖培養基，以104/孔的密度接種于96 孔細胞培養板后培養3 d，每2 d 換液1 次，培養箱環境為95%空氣+ 5% CO2，溫度37 ℃。待細胞融合度為80%時利用Ploybrene 慢病毒，參照說明書對細胞進行慢病毒轉染，將miR-27a-3p 模擬物（Mimic）、模擬物陰性對照、抑制劑（Inhibitor）和抑制劑陰性對照轉染入細胞，轉染24 h 后于熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，檢測轉染效率。

1.3 PC12 細胞 OGD/R 模型的制備 將 PC12 細胞用無糖培養基于37 ℃培養箱（95%N2+5%CO2）中培養（即氧糖缺失）2 h，之后將培養基更換為正常培養基，于37 ℃培養箱（95%空氣+5%CO2）中繼續培養（即復糖復氧），制備OGD/R模型。

1.4 細胞增殖檢測 采用CCK-8 實驗法。采用隨機數字表法將PC12細胞分為6組，每組取6孔：正常對照組（Ctrl 組）、氧糖缺失-復氧復糖組（OGD/R組）、miR-27a-3p 模擬物組（Mimics 組）、miR-27a-3p模擬物陰性對照組（Ctrl-M 組）、miR-27a-3p 抑制劑組（Inhibitor 組）和miR-27a-3p 抑制劑陰性對照組（Ctrl-I 組）。Ctrl 組細胞進行正常培養；OGD/R 組分別于復氧復糖后 24 、48 、72 和 96 h 制備 OGD/R 模型；Mimics 組、Ctrl-M 組、Inhibitor 組和 Ctrl-I 組分別用加有Ploybrea 慢病毒感染細胞24 h 后進行miR-27a-3p的過表達、過表達陰性對照、抑制表達和抑制表達陰性對照后，再分別于復氧復糖后24、48、72 和96 h 制備OGD/R 模型。然后將各組細胞以2×103個/孔的密度接種到96孔板中，37 ℃培養過夜。次日，每孔加入預制的CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h后，用酶標儀測量不同時間點各組細胞450 nm處的光密度值。

1.5 OGD/R 后不同時點miR-27a-3p 表達和各組細胞凋亡相關基因表達檢測 采用RT-qPCR 法。采用隨機數字表法將細胞分為Normal組、3 h組、6 h組和9 h 組，每組取6 孔。Normal 組細胞進行正常培養，3 h組、6 h組和9 h組進行2 h的氧糖缺失后分別復氧復糖3、6 和9 h 制備OGD/R 模型。分別測定各組相應時點miR-27a-3p 表達，并選擇表達差異最大的時點作為后續研究的時點，并按照1.4 的分組和處理分別測定各組miR-27a-3p 和促凋亡基因Caspase-3、Bax 及抗凋亡基因 Bcl-2 的 mRNA 相對表達量。TRIzol 法提取細胞總RNA，-80 ℃冰箱保存備用 。 取 1 μg RNA 按 照 MicroRNAs 逆 轉 錄 試 劑盒、mRNA 逆轉錄試劑盒的說明書進行逆轉錄反應合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），采用Sybrgreen 法，在CFX96 實時熒光定量PCR 儀進行擴增和檢測。mRNA 逆轉錄體系：20 μL（Mix 1 μL，Buffer 4 μL，樣品10 μL，ddH2O 5 μL）；條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。miRNA逆轉錄體系：20 μL（Mix 1 μL，polyA 1 μL，Buffer 5 μL，樣品 10 μL，ddH2O 8 μL）。條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。引物序列：miR-27a-3p：正向引物：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3'，反向引物：5'-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3'；Caspase-3 正 向 引 物 ：5'-TGAAAGACAAGCCCAAGGTTA-3'，反向引物：5'-TGGTGTTGAAGAGCAGAAAGC-3'；Bax 正 向 引 物 ：5'-CCCGAGAGGTCTTTTTCCG-3'，反向引物：5'-GCCTTGAGCACCAGTTTGC-3'；Bcl-2 正向引物：5'-GAGGGGCTACGAGTGGGAT-3'，反向引物：5'-GGGCTGGGAGGAGAAGATG-3'；U6 正向引物：5'-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-GAGGTATTCGCACCAGAGGA-3'；β-actin 正向引物：5'-TGGCATCCACGAAACTACCTT-3'，反向引物：5'-AGACAGCACTGTGTTGGCGTA-3'。PCR 反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 15 s 共循環 40 次，采集記錄熒光。最后得到 S 形動力曲線，讀取 Ct 值，用 2-ΔΔCt方法，與U6、β-actin 進行校正后計算出基因的相對表達量。

1.6 各組細胞凋亡相關蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。按照1.4 的分組，各組細胞中加入適量RIPA 裂解液，于冰上充分裂解后取上清，用BCA 法測定蛋白濃度。在SDS-PAGE 凝膠系統中電泳，進行轉膜后，用5% 的脫脂奶粉封閉2 h后加入一抗 Cleaved-Caspase-3（濃度 1∶1 000）、Bax（濃度1∶1 000）、Bcl-2（濃度 1∶1 000），4 ℃過夜。TBST 洗膜后，加入二抗（濃度1∶5 000），室溫孵育2 h，ECL 顯影。于凝膠成像儀采集圖像信息，用Image J 軟件測得各蛋白的灰度值，與相應的β-actin 灰度值相比后分析得出各蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料符合正態分布以表示，不同組間比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-27a-3p在PC12細胞中OGD/R后不同時間點的表達 Normal 組、3 h 組、6 h 組和 9 h 組 miR-27a-3p 的相對表達量分別為 1.006 ± 0.140、0.449 ±0.025、0.306 ± 0.028、0.492 ± 0.027，與 Normal 組相比，miR-27a-3p的相對表達量在3 h組、6 h組和9 h組均降低（P均＜0.05），組間比較，6 h 組相對表達量最低（P＜0.05）。后續凋亡實驗中選擇OGD/R后6 h時點進行研究。

2.2 miR-27a-3p 對 OGD/R 損 傷 PC12 細 胞 增 殖 活性的影響 與Ctrl 組相比，復氧復糖后48、72 和96 h，OGD/R 組細胞的增殖活性均降低（P均＜0.05）；與 Mimics-Ctrl 組相比，24、48、72 和 96 h，Mimics 組細胞增殖活性均升高（P均＜0.05）；與 Inhibitor-Ctrl組相比，72和96 h時Inhibitor組細胞增殖活性均降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組PC12細胞增殖活性比較（）

表1 各組PC12細胞增殖活性比較（）

注：與Ctrl組相比，*P＜0.05；與Mimics-Ctrl組相比，#P＜0.05；與Inhibitor-Ctrl組相比，&P＜0.05。

組別Ctrl組OGD/R組Mimics組Mimics-Ctrl組Inhibitor組Inhibitor-Ctrl組OD值96 h 1.804±0.044 1.552±0.046 *2.065±0.095 #1.544±0.158 1.378±0.103 &1.553±0.060 24 h 0.414±0.014 0.369±0.011 0.513±0.012 #0.360±0.012 0.347±0.017 0.352±0.009 48 h 0.784±0.072 0.591±0.017 *0.751±0.047 #0.615±0.032 0.480±0.027 0.555±0.045 72 h 1.394±0.017 1.246±0.133 *1.627±0.011 #1.337±0.068 1.006±0.146 &1.299±0.252

2.3 miR-27a-3p對OGD/R損傷PC12細胞凋亡相關因子表達的影響 與Ctrl組相比，OGD/R組miR-27a-3p 表達降低（P＜0.05），促凋亡因子 Caspase-3、Bax的mRNA 和蛋白相對表達量均升高（P均＜0.05）、抗凋亡因子Bcl-2表達量降低（P＜0.05）；與Mimics-Ctrl組相比，Mimics 組 miR-27a-3p 表達升高（P＜0.05），Caspase-3、Bax 的mRNA 和蛋白相對表達量均降低（P均＜0.05），Bcl-2 表達升高（P＜0.05）；與Inhibitor-Ctrl 組相比，Inhibitor 組 miR-27a-3p 表達降低（P＜0.05），Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白相對表達量均升高（P均＜0.05），Bcl-2表達降低（P＜0.05）。見表2、表3。

表2 各組細胞miR-27a-3p和凋亡相關因子mRNA相對表達量比較（）

表2 各組細胞miR-27a-3p和凋亡相關因子mRNA相對表達量比較（）

注：與Ctrl組相比，*P＜0.05；與Mimics-Ctrl組相比，#P＜0.05；與Inhibitor-Ctrl組相比，&P＜0.05。

組別Ctrl組OGD/R組Mimics組Mimics-Ctrl組Inhibitor組Inhibitor-Ctrl組Bcl-2 1.006±0.057 0.429±0.042 *1.547±0.066 #0.468±0.114 0.144±0.005 &0.359±0.060 miR-27a-3p 1.020±0.241 0.269±0.003 *1.100±0.334 #0.296±0.047 0.070±0.011 &0.228±0.022 Caspase-3 1.023±0.110 2.506±0.238 *0.558±0.073 #2.541±0.141 5.729±0.235 &2.570±0.177 Bax 1.032±0.101 3.093±0.681 *0.282±0.070 #2.558±0.188 6.230±0.510 &3.008±0.084

表3 各組細胞miR-27a-3p和凋亡相關因子蛋白相對表達量比較（）

表3 各組細胞miR-27a-3p和凋亡相關因子蛋白相對表達量比較（）

注：與Ctrl組相比，*P＜0.05；與Mimics-Ctrl組相比，#P＜0.05；與Inhibitor-Ctrl組相比，&P＜0.05。

組別Ctrl組OGD/R組Mimics組Mimics-Ctrl組Inhibitor組Inhibitor-Ctrl組Bcl-2 0.879 0±0.011 6 0.689 9±0.009 7 *1.229 0±0.007 4 #0.663 8±0.009 5 0.087 7±0.010 5 &0.289 7±0.010 0 Cleaved-Caspase-3 0.456 8±0.003 1 0.878 6±0.001 1 *0.010 0±0.000 0 #0.735 2±0.000 8 0.987 6±0.002 4 &0.558 3±0.000 3 Bax 0.489 2±0.002 3 1.327 3±0.000 3 *0.082 1±0.000 0 #1.295 5±0.000 5 2.287 4±0.008 6 &0.931 9±0.000 1

3 討論

CI-RI是缺血性腦卒中較嚴重的一種病理損傷過程，其發生率和病死率較高，臨床防治較難。miRNAs 是一類非編碼的小分子RNA，其通過綁定3′非翻譯區的靶標，導致mRNA 降解或翻譯受阻來調節編碼蛋白質的基因表達，近年研究發現，miRNAs 廣泛參與神經系統疾病的各種病理過程，被認為是各種神經系統疾病潛在的治療靶點之一［9］。miR-27a-3p 位于19 號染色體，被認為是一種致癌基因，可促進包括結直腸癌、胃癌和食管癌在內的癌細胞惡性行為［10］。近年研究主要關注miR-27a-3p 在非腫瘤性疾病中的抗炎、抗細胞凋亡和促進增殖等方面的作用。在兔骨關節炎體內外模型研究中，ZHANG等［11］研究發現，轉染 miR-27a-3p 模擬物可促進軟骨細胞增殖，同時降低炎性因子表達。JU 等［12］研究表明，miR-27a-3p 能抑制脂多糖誘導的急性肺損傷所致的細胞凋亡。

研究表明，大量miRNA 在腦缺血或再灌注損傷后表達發生改變，參與了缺血性腦卒中損傷與恢復過程的調控［13］。本研究發現，OGD/R 損傷后 miR-27a-3p表達降低，表明miR-27a-3p參與了OGD/R 損傷的病理過程。進一步研究miR-27a-3p 對OGD/R損傷后細胞增殖的作用結果發現，過表達miR-27a-3p 后在復氧復糖 24、48、72 和 96 h 時細胞增殖活性均升高，而抑制 miR-27a-3p 表達后，在 72 和 96 h 細胞的增殖活性降低，證實miR-27a-3p 能促進OGD/R損傷后 PC12 細胞的增殖。XU 等［14］研究發現，下調miR-27a-3p 在胃壁癌細胞中表達后，細胞增殖速度減慢，擴散和遷移能力下降。BAI 等［15］研究證實，miR-27a-3p 過表達促進了大鼠股骨頭壞死模型成骨細胞的分化和增殖。此外，miR-27a-3p 下調增加了大鼠腦微血管內皮細胞（BMEC）的單層通透性，抑制了 BMEC 增殖［16］。上述研究均表明 miR-27a-3p 具有促進細胞增殖的作用，我們的研究則在體外模型中證實了這一結論。

B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白在調節細胞凋亡過程中發揮關鍵作用，包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL 和促凋亡蛋白 Bax、Bak 等［17］。Caspase 家族亦是促進凋亡的重要蛋白家族，是各種凋亡途徑的共同通路，而Caspase-3 是其主要成員之一，通過多種凋亡途徑促進細胞凋亡［18］。本研究結果顯示，OGD/R損傷后促凋亡蛋白的表達均升高，抗凋亡蛋白表達降低；過表達miR-27a-3p 后促凋亡蛋白表達降低，而抗凋亡蛋白表達升高，抑制miR-27a-3p 表達則逆轉了以上結果。表明在OGD/R 損傷的PC12細胞模型中，miR-27a-3p 具有抑制細胞凋亡的作用。SUN等［19］研究發現，在內皮細胞中上調miR-27a-3p 表達能抑制Fas 相關蛋白與死亡域（FADD）的表達上調及細胞凋亡途徑的激活，從而抑制內皮細胞的凋亡，促進血管重塑，對主動脈夾層具有保護作用。TANG 等［20］研究表明，過表達 miR-27a-3p 降低了高糖誘導損傷的視網膜色素細胞的Caspase-3/9的活性和Bax 蛋白表達，抑制了細胞凋亡，從而保護了該類細胞免受高糖損傷。XI 等［16］研究表明，在腦出血的動物模型中，miR-27a-3p 模擬物的治療抑制了血腫周圍神經元的凋亡和水通道蛋白的上調，發揮了神經保護作用。我們的研究則進一步證實了miR-27a-3p 在CI-RI細胞模型中具有抑制凋亡的細胞保護作用。

綜上所述，miR-27a-3p 在 OGD/R 損傷 PC12 細胞中呈低表達，miR-27a-3p 能促進OGD/R 損傷PC12細胞的增殖并抑制其凋亡。