虎杖苷對糖尿病小鼠心肌纖維化的保護作用及機制

陳瑞敏，陳偉 ，李建耿，李寧，談紅

1 解放軍聯勤保障部隊第九六〇醫院心內科，濟南250031；2 山東第一醫科大學第三附屬醫院心內科

糖尿病心肌病（DCM）是一類獨立于高血壓、動脈粥樣硬化的特異性心肌病，早中期可出現不同程度的心功能受損，終末期可致心力衰竭甚至死亡。1972年RUBLER 等［1］首先提出糖尿病心肌病這一概念，近年來，國內外學者進行了大量的基礎實驗和臨床研究，但仍未能完全闡明其發病機制。糖尿病心肌病發病機制較復雜，可能涉及炎癥反應、內質網應激、氧化應激、PKC 途徑激活、細胞凋亡等［2］，而心肌纖維化是糖尿病心肌病的特征性病理表現［3］。轉化生長因子β1（TGF-β1）是目前已知的與組織纖維化關系最密切的細胞因子［4］，心肌成纖維細胞在纖維化進程及心肌組織重構中扮演重要角色。正常生理狀態下時，心肌成纖維細胞呈靜態，作為心肌間質細胞的主要成分可維護心肌的功能和形態。但在高血糖、炎癥、氧化應激等諸多致病因素刺激下，TGF-β1被激活，促使Smad 2/3 磷酸化并進入細胞核，誘導心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，發生異常增殖、遷移，合成大量的細胞外基質蛋白，促進心肌重構［5］。虎杖苷（Polydatin）是從蓼科植物虎杖的干燥根莖中提取的一種有效單體成分［6］。目前研究表明，虎杖苷具有抗炎、抗氧化損傷、降血脂、抗動脈粥樣硬化、減輕心肌再灌注損傷作用［7］。新近研究證實，虎杖苷干預可抑制CCl4所致的肝纖維化，還可減輕博來霉素誘導的肺纖維化［8］。但有關虎杖苷干預糖尿病心肌纖維化進程的研究至今尚未見報道。本研究中，我們擬觀察虎杖苷對糖尿病小鼠心肌纖維化的影響，為虎杖苷在糖尿病心肌病臨床治療中的應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性 C57 小鼠 32 只，體質量（25.32 ±2.57）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。虎杖苷、鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自Sigma公司，兔 抗鼠 Collagen Ⅰ 、Collagen Ⅲ 、TGF-β1，Smad3及 α-SMA、Fibronectin（FN）購自Abcam公司，山羊抗兔IgG/HRP二抗試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。天狼星紅（Sirius Red）、Masson染色試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.2 動物分組與處理 取32只雄性C57小鼠，隨機取8 只作為正常對照組，其余24 只制作糖尿病模型。STZ 以60μg/g 劑量一次性腹腔注射制備糖尿病模型。1周后測血糖，將2次隨機血糖＞16.7 mmol/L判定為為符合糖尿病模型標準。然后將糖尿病小鼠分為三組：糖尿病組、虎杖苷低劑量組、虎杖苷高劑量組，虎杖苷低劑量組給予虎杖苷100 mg/（kg.d）灌胃，虎杖苷高劑量組給予虎杖苷200 mg/（kg. d）灌胃給藥；正常對照組及糖尿病組給予等體積溶劑。持續干預12周后，二維超聲檢測左室舒張早期最大血流/二尖瓣心房收縮期最大血流（E/A）、左室射血分數（LVEF）和左室短軸縮短率（FS）、左室后壁厚度（LVPWD）。處死小鼠，留取心臟，分裝標本。

1.3 膠原纖維含量測定 4% 多聚甲醛溶液中固定心臟標本，常規石蠟包埋、切片，脫蠟后進行天狼星紅（Sirius Red）、Masson 染色。采用Image-pro Plus軟件分析膠原纖維含量。

1.4 心肌組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達檢測 采用免疫組化法。石蠟切片脫蠟后進行抗原修復，分別滴加兔抗鼠 Collagen Ⅰ（1∶200）、Collagen Ⅲ（1∶200），4 ℃過夜后滴加山羊抗兔IgG/HRP二抗，37 ℃孵育1 h，DAB顯色。蘇木素染核后脫水透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.5 TGF-β1、Smad3、α-SMA 蛋白表達檢測 采用免疫印跡（Western blotting）法。RIPA 裂解液提取心肌組織總蛋白，BCA 法測量蛋白濃度后，進行SDSPAGE垂直電泳，電轉至PVDF 膜上。脫脂牛奶封閉后 ，分 別 以 一 抗 TGF-β1（1∶1 000）、Smad3（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、及GAPDH（1∶5 000）孵育過夜。TBST 洗滌后，室溫下孵育二抗30 min，ECL發光液顯色。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。計量資料符合正態分布用表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 虎杖苷對糖尿病小鼠血糖及心功能的影響 與對照組相比，糖尿病小鼠空腹血糖濃度升高（P＜0.05），而虎杖苷處理未對糖尿病小鼠空腹血糖產生明顯影響，見表1。糖尿病小鼠E/A、LVEF、FS下降（P均＜0.05），LVPWD 上升（P＜0.05），糖尿病小鼠心功能受損，而虎杖苷處理后能改善上述心功能指標，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組空腹血糖及超聲心動圖檢測結果比較（）

表1 各組空腹血糖及超聲心動圖檢測結果比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組糖尿病組虎杖苷低劑量組虎杖苷高劑量組LVPWD（mm）0.566±0.065 0.775±0.062*0.673±0.038#0.624±0.054#n 8 8 8 8空腹血糖（mmol/L）6.30±0.56 22.30±2.41*21.24±2.26*20.99±2.28*E/A 1.55±0.14 0.64±0.17*1.03±0.16#1.19±0.22#LVEF（%）78.50±3.07 50.75±5.34*61.88±2.95#68.38±3.02#FS（%）32.88±3.98 18.88±3.76*23.63±2.83#28.25±1.83#

2.2 各組心肌組織膠原含量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原水平比較 天狼星紅（Sirius Red）、Masson 染色顯示，糖尿病組小鼠心肌間質膠原纖維明顯增加且排列紊亂，膠原含量相對于正常對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。糖尿病組小鼠心肌組織Ⅰ型及Ⅲ型膠原增加，而虎杖苷干預可抑制Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組心肌組織膠原含量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原水平比較（）

表2 各組心肌組織膠原含量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原水平比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組糖尿病組虎杖苷低劑量組虎杖苷高劑量組n 8 8 8 8膠原百分比3.37±0.16 30.31±4.41*17.65±2.39#9.95±1.79#Ⅰ型膠原表達8.55±1.25 25.64±5.17*16.23±2.14#9.34±1.27#Ⅲ型膠原表達8.38±1.47 21.72±2.34*15.85±1.95#9.54±1.35#

2.3 虎杖苷干預對糖尿病小鼠心肌組織TGF-β1/Smads 信號通路的影響 與正常對照組相比，糖尿病小鼠心肌組織TGF-β1、磷酸化Smad3 水平增加，同時α-SMA表達增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組心肌組織TGF-β1、P-Smads、α-SMA表達比較（）

表3 各組心肌組織TGF-β1、P-Smads、α-SMA表達比較（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組糖尿病組虎杖苷低劑量組虎杖苷高劑量組α-SMA相對表達1.06±0.16 2.71±0.46*1.61±0.23#1.55±0.21#n 8 8 8 8 TGF-β1相對表達1.02±0.17 2.15±0.14*1.48±0.15#1.39±0.12#P-Smad3相對表達1.08±0.18 2.08±0.26*1.63±0.23#1.45±0.21#

3 討論

心肌纖維化是糖尿病心肌病的重要病理特征，各種理化因素導致心肌間質膠原大量沉積，能降低心肌順應性，從而影響心臟的收縮及舒張功能。我們用心臟超聲檢測糖尿病小鼠心功能，發現糖尿病病程12 周后，與正常對照組相比，舒張功能指標E/A下降，同時心臟收縮功能指標LVEF、FS降低，差異有統計學意義，提示糖尿病12周即出現明顯的心功能受損。此外，天狼星紅（Sirius Red）、Masson 染色均顯示，糖尿病小鼠心肌間質膠原纖維明顯增加。免疫組化結果顯示，糖尿病小鼠心肌組織膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的沉積顯著增加。上述指標均表明糖尿病小鼠存在明顯心肌纖維化。

虎杖苷，又稱白藜蘆醇苷，是白藜蘆醇與葡萄糖結合的產物，可通過抗氧化、改善血液流變學、調節離子通道以及蛋白激酶的方式，發揮抗心肌缺血/再灌注損傷、抗心肌肥厚、抗動脈粥樣硬化等心血管藥理學作用［9］。新近研究也證實，虎杖苷可減輕CCl4所致的肝纖維化，并抑制博來霉素誘導的肺纖維化［10］。本研究結果顯示，與糖尿病組相比，虎杖苷干預后糖尿病小鼠心臟功能明顯改善，E/A、LVEF、FS 升高，LVPWD 降低，差異有統計學意義；心肌間質膠原纖維化面積降低；免疫組化結果顯示，虎杖苷能有效抑制心肌組織膠原Ⅰ、膠原Ⅲ的沉積，且呈一定的劑量依賴性。表明虎杖苷治療能明顯改善糖尿病小鼠的心臟舒縮功能，減輕其纖維化損害。

大量研究證實，TGF-β/Smads 信號通路與心血管重塑密切相關，參與了高血壓病、冠心病、心肌梗死、心肌病及心力衰竭的發生發展［11］。TGF-β1是刺激膠原生成、導致心肌纖維化的主要細胞因子［12］。心肌纖維化的發生常伴隨TGF-β1及下游Smad2、Smad3的激活［13］。MA等［14］研究報道在心肌梗死瘢痕區TGF-β1及Smad 2、3、4 表達增加，而有抑制作用的Smad 7 的表達則降低。而心肌特異性敲除Tgfbr1/2或者Smad3 能減輕壓力負荷導致的心肌纖維化反應。同時，TGF-β/Smads 在糖尿病心肌纖維化中起重要作用。TOKUDOME 等［15］體外培養心肌成纖維細胞，發現高糖刺激能增加TGF-β1的表達，同時增加膠原的合成，且膠原增加程度與TGF-β1表達呈正比。體內研究證實，STZ 誘導的糖尿病小鼠存在明顯的心肌纖維化，同時TGF-β1/Smads 通路明顯激活［16］。而針對 TGF-β/Smads 通路的治療策略則能緩解糖尿病心肌纖維化、改善糖尿病心功能［17］。本研究結果表明，STZ誘導的糖尿病小鼠心肌TGF-β1、磷酸化Smad3 水平增加，同時纖維連接蛋白FN、α-SMA 表達增加，且伴有顯著的心肌纖維化、心功能降低；而虎杖苷干預能減輕其纖維化程度。但我們未發現虎杖苷能明顯改善糖尿病小鼠的血糖，為進一步探討虎杖苷糖尿病心肌纖維化的分子機制，我們研究了虎杖苷對TGF-β1/Smad3信號通路的影響。結果證實，虎杖苷干預可抑制糖尿病引起的TGF-β1活化及Smad3 的磷酸化；同時抑制了纖維連接蛋白FN、α-SMA表達。

綜上所述，虎杖苷可減輕糖尿病心肌纖維化并改善心功能，且呈現劑量依賴性。其機制可能與下調TGF-β1/Smad3，抑制膠原Ⅰ、Ⅲ沉積有關。