連夏配方顆粒對(duì)心肌梗死大鼠心率變異性和炎癥反應(yīng)的影響*

李賽賽，李家立，戴方圓，孟園，李平

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029； 2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272029

連夏配方顆粒由黃連溫膽湯化裁而來(lái)，具有清熱化痰、寧心安神的功效[7]。前期研究證明，連夏配方顆粒可明顯改善心肌梗死大鼠心臟自主神經(jīng)重構(gòu)[8]，提高心梗大鼠室顫閾值[9]，有效減少腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心律失常的持續(xù)時(shí)間[10]。但是對(duì)連夏配方顆粒干預(yù)心肌梗死后HRV及炎癥反應(yīng)的作用有待進(jìn)一步研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量200～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。實(shí)驗(yàn)得到濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。飼養(yǎng)環(huán)境清潔，室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度45%～65%，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，光照周期12 h/12 h明暗交替。

1.2 藥物及試劑連夏配方顆粒(黃連6 g，姜半夏6 g)(北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：17025661)；酒石酸美托洛爾片(阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)：190710)。注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F6032104)；戊巴比妥鈉(美國(guó)sigma公司，批號(hào)：T0894)；白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β) 試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SEKR0002)；核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司，批號(hào)：MB-6640A)；40 ng·L-1多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：P1110-100)；伊紅染液(武漢賽維爾生物有限公司，貨號(hào)：G1005)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：100092683)；二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：10023418)；中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：10004160)。

1.3 儀器酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Multiskan MK3)；脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JJ-12J)；包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JB-P5)；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016)；低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)：5810R)；小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物有限公司，型號(hào)：ALC-V8S)；PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(澳大利亞ADinstruments公司，型號(hào)：PL3508)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立心肌梗死模型采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備心肌梗死大鼠模型[11-12]。首先，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(45 mg·kg-1)進(jìn)行麻醉，備皮后經(jīng)氣管插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，在第 3～4肋骨之間逐層開(kāi)胸，左心耳下2 mm處用5號(hào)手術(shù)線(xiàn)穿線(xiàn)并結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎點(diǎn)以下的心肌搏動(dòng)減弱，心肌組織變蒼白，心電圖ST段弓背向上抬高并持續(xù)15 min以上作為評(píng)判心肌梗死造模成功的標(biāo)志[13]。假手術(shù)組平行操作，但只穿線(xiàn)不結(jié)扎。術(shù)后腹腔注射青霉素4萬(wàn)單位預(yù)防感染。大鼠造模心電圖見(jiàn)圖1。

圖1 心肌梗死模型制備前后Ⅱ?qū)?lián)心電圖

2.2 大鼠分組及給藥術(shù)后24 h，將造模成功的50只大鼠隨機(jī)分為模型組、連夏配方顆粒(高、中、低劑量)組和美托洛爾組，每組10只，另設(shè)假手術(shù)組8只。根據(jù)等效劑量折算法[14]，實(shí)驗(yàn)大鼠連夏配方顆粒高劑量為189.00 mg·kg-1、連夏配方顆粒中劑量為94.50 mg·kg-1、連夏配方顆粒低劑量為47.25 mg·kg-1，假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)30 d。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1 HRV檢測(cè)治療30 d后，進(jìn)行HRV檢測(cè)，具體操作如下：大鼠麻醉后仰臥位固定，采用針行電極插入大鼠左、右后肢及右前肢肌肉，連接PowerLab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。隨機(jī)選取大鼠安靜狀態(tài)下5 min心電圖，通過(guò)快速傅立葉變換得到HRV頻域指標(biāo)推測(cè)心臟交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)在調(diào)節(jié)心臟活動(dòng)中的緊張性和平衡性[15]，主要包括低頻功率(low-frequency power，LF，0.2～0.75 Hz)、高頻功率(high-frequency power，HF，0.75～2.5 Hz)及低頻功率與高頻功率的比值(LF/HF)。其中，HF表示迷走神經(jīng)活性，LF表示交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)的共同活動(dòng)，但更多的受交感神經(jīng)活性影響，LF/HF水平反映了交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)支配的均衡性[16]。

替格瑞洛治療老年急性冠脈綜合征患者的效果及對(duì)炎性因子、心功能的影響……………………… 鄭舒 周冬翠 畢磊 等（4）446

2.3.2 血清炎癥因子的檢測(cè)ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清NF-κB、IL-1β水平。

2.3.3 HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化每組隨機(jī)選擇3只大鼠，在心肌梗死邊緣區(qū)獲取心肌組織，①采用40 ng·L-1多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋后制成厚度為4 μm的切片；②石蠟切片脫蠟：依次將切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min，梯度乙醇逐級(jí)下行脫水各5 min，自來(lái)水沖洗，用吸水紙擦干周邊；③蘇木精染色：切片入蘇木精染液 3～5 min，自來(lái)水洗，分化液分化，自來(lái)水洗，并洗滌藍(lán)化；④伊紅染色：切片依次入85%、95%的梯度乙醇脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min；⑤脫水封片：將切片再次放入梯度乙醇中上行脫水各5 min，放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明5 min，中性樹(shù)膠封片；⑥顯微鏡鏡檢，采集圖像，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般情況假手術(shù)組大鼠狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，進(jìn)食飲水正常，毛色光滑柔順，舌苔四肢粉紅，呼吸正常；模型組(死亡2只)大鼠狀態(tài)差，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食、飲水減少，易驚嚇易激惹，出現(xiàn)抱團(tuán)、消瘦現(xiàn)象，毛色粗糙、無(wú)光澤，舌色紫黯，四肢發(fā)紺，仰頭呼吸；連夏配方顆粒高劑量組(死亡1只)和美托洛爾組(死亡2只)大鼠較模型組改善明顯，進(jìn)食飲水尚正常，偶見(jiàn)易激惹狀態(tài)，毛色尚可，舌色紅黯；連夏配方顆粒中劑量組(死亡2只)較模型組有所好轉(zhuǎn)，一般狀況尚可；連夏配方顆粒低劑量組(死亡2只)精神狀態(tài)稍差，也可見(jiàn)消瘦、毛色粗糙等。

3.2 大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心電圖出現(xiàn)病理性Q波；與模型組比較，美托洛爾組未見(jiàn)病理性Q波；連夏配方顆粒高劑量組病理性Q波明顯減小；連夏配方顆粒中、低劑量組病理性Q波也有減小趨勢(shì)，但不如連夏配方顆粒高劑量組改善明顯。見(jiàn)圖2。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：美托洛爾組；D：連夏配方顆粒高劑量組；E：連夏配方顆粒中劑量組；F：連夏配方顆粒低劑量組圖2 各組大鼠的Ⅱ?qū)?lián)心電圖

3.3 大鼠HRV的測(cè)定與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LF、LF/HF顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，連夏配方顆粒高、中、低劑量組和美托洛爾組LF顯著提高(P<0.01)，連夏配方顆粒高劑量組LF/HF顯著升高(P<0.01)，連夏配方顆粒中劑量組和美托洛爾組LF/HF明顯升高(P<0.05)。各組之間HF未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠HRV結(jié)果比較

3.4 大鼠心肌組織病理學(xué)變化假手術(shù)組大鼠心肌肌束形態(tài)完整，纖維結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核邊界清晰；模型組大鼠心梗邊緣區(qū)心肌細(xì)胞腫脹、排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，細(xì)胞核有破裂、溶解消失現(xiàn)象，心肌間質(zhì)出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；連夏配方顆粒高劑量組和美托洛爾組心肌纖維排列較為整齊，細(xì)胞核大小均勻，壞死心肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕；連夏配方顆粒中劑量組心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)少量心肌細(xì)胞松散、水腫；連夏配方顆粒低劑量組心肌組織上述病理改變有所減輕，但仍存在部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖3。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：美托洛爾組；D：連夏配方顆粒高劑量組；E：連夏配方顆粒中劑量組；F：連夏配方顆粒低劑量組圖3 大鼠心肌組織病理學(xué)變化(HE，×400)

3.5 大鼠血清NF-κB、IL-1β水平的測(cè)定與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清NF-κB、IL-1β水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，連夏配方顆粒高劑量組和美托洛爾組大鼠血清NF-κB、IL-1β 水平顯著降低(P<0.01)；連夏配方顆粒中劑量組血清NF-κB、IL-1β具有不同程度的降低(P<0.05，P<0.01)，連夏配方顆粒低劑量組未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清NF-κB、IL-1β水平比較

3.6 HRV與血清NF-κB、IL-1β的相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，各組大鼠HRV頻域指標(biāo)LF、LF/HF與血清NF-κB、IL-1β呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，HF與血清NF-κB、IL-1β無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 HRV與血清NF-κB、IL-1β的相關(guān)性分析

4 討論

根據(jù)《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2019概要》[17]，目前我國(guó)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者已達(dá)1 100萬(wàn)，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康，對(duì)社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。HRV是目前客觀評(píng)價(jià)心臟自主神經(jīng)功能狀態(tài)無(wú)創(chuàng)、定量的敏感指標(biāo)。研究表明，HRV與心力衰竭、惡性心律失常、心肌梗死后猝死等密切相關(guān)，早期有效干預(yù)對(duì)提高HRV具有重要的臨床意義[18-19]。

心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)包括交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)，二者共同構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控心臟泵血功能、心肌電活動(dòng)穩(wěn)定性等。發(fā)生梗死后，心肌急性缺血缺氧或局部梗死，使心臟節(jié)段性自主神經(jīng)末梢受損，梗死區(qū)自主神經(jīng)壞死，心肌去神經(jīng)化，而梗死邊緣區(qū)部分未壞死的神經(jīng)軸突不均勻過(guò)度再生，導(dǎo)致心梗后機(jī)體的交感神經(jīng)活性過(guò)度激活、迷走神經(jīng)活性相對(duì)降低[20]。心梗后自主神經(jīng)功能失衡，對(duì)心臟竇房結(jié)的調(diào)節(jié)能力減弱，HRV相關(guān)指標(biāo)LF、LF/HF水平降低，心肌電活動(dòng)的不穩(wěn)定性增加，易發(fā)生各種惡性心律失常、心源性猝死等危及生命。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”等范疇。隨著生活水平提高、精神壓力增加等，致使痰濁內(nèi)生、郁久化熱，痰熱型冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病在當(dāng)今社會(huì)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，臨床應(yīng)重視痰熱型冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者[21]。心主血脈，亦主神明，痰熱壅滯，痹阻心脈，擾亂心神，發(fā)為胸痹。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病痰熱證患者易出現(xiàn)胸悶胸痛、心煩急躁、焦慮失眠、口干口苦、舌紅苔黃膩、脈滑數(shù)等臨床表現(xiàn)，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)自主神經(jīng)功能失調(diào)的諸多癥狀相符合。王林海等[22]也認(rèn)為，痰熱型冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者存在交感神經(jīng)興奮趨勢(shì)。研究表明，自主神經(jīng)系統(tǒng)在“心主血脈”與“心主神明”之間發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用[23]。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病痰熱證與自主神經(jīng)功能失調(diào)密切相關(guān)，自主神經(jīng)功能失調(diào)既是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的重要原因，又是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要病理環(huán)節(jié)和癥狀表現(xiàn)[24-25]。因此，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的治療不僅要強(qiáng)調(diào)心肌灌注不足的改善，更要重視對(duì)自主神經(jīng)功能紊亂的調(diào)節(jié)。

基于上述觀點(diǎn)，李平教授在多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，融合國(guó)醫(yī)大師路志正“調(diào)脾護(hù)心”的學(xué)術(shù)思想和王永炎院士“毒損脈絡(luò)”理論，創(chuàng)立了連夏配方顆粒，方中黃連苦寒，清熱燥濕、瀉火解毒，姜半夏辛溫，化痰散結(jié)、降逆止嘔，二者寒熱并用以和陰陽(yáng)，辛開(kāi)苦降以調(diào)升降，有相輔相成之妙用，全方共奏清熱化痰以暢血脈，寧心安神以調(diào)神明，達(dá)到血脈-神明共治之效，對(duì)痰熱型冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病伴有自主神經(jīng)功能紊亂患者尤為適宜。

炎癥反應(yīng)在心肌梗死發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[26]。適度的炎癥反應(yīng)有利于機(jī)體抵抗病原的侵襲、清除壞死組織、促進(jìn)損傷修復(fù)，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)加速心血管局部斑塊破裂，增加惡性心血管事件。研究發(fā)現(xiàn)，自主神經(jīng)系統(tǒng)與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[27]。迷走神經(jīng)通過(guò)“膽堿能抗炎通路”可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)[28]，而交感神經(jīng)因受到神經(jīng)遞質(zhì)和免疫細(xì)胞腎上腺素受體亞型影響對(duì)炎癥反應(yīng)具有促炎和抗炎的雙向調(diào)節(jié)作用[29]。同時(shí)，炎癥反應(yīng)產(chǎn)物亦可通過(guò)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)反向作用激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致自主神經(jīng)功能進(jìn)一步惡化[30]。藥理學(xué)研究表明，黃連、姜半夏具有顯著的抗炎作用[31-32]，改善自主神經(jīng)紊亂同時(shí)減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)是防治心肌梗死的新領(lǐng)域。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，連夏配方顆粒高、中劑量組提高心肌梗死大鼠LF、LF/HF，心肌結(jié)構(gòu)排列較為規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，血清 NF-κB、IL-1β水平降低，說(shuō)明連夏配方顆粒可提高心梗大鼠HRV，改善自主神經(jīng)功能，減輕炎癥反應(yīng)。同時(shí)，HRV相關(guān)指標(biāo)LF、LF/HF與血清炎癥因子NF-κB、IL-1β水平具有良好相關(guān)性。提示連夏配方顆粒可能通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)了心梗大鼠的自主神經(jīng)功能。

綜上所述，連夏配方顆粒可提高心梗大鼠HRV、減輕炎癥反應(yīng)，本研究為臨床上從痰熱治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病自主神經(jīng)功能失調(diào)提供依據(jù)，但其具體作用機(jī)制尚需深入研究。