石菖蒲通過CXCR4-PI3K信號通路對腦出血大鼠小膠質細胞自噬的影響*

李芝明，付勝奇，劉變化，劉欣

1.鄭州人民醫院，河南 鄭州 450053； 2.鄭州大學附屬鄭州中心醫院，河南 鄭州 450007

腦出血是腦卒中的一種，世界范圍內每年發病人數約為200萬，致死率、致殘率極高，嚴重影響患者的生命健康及生存質量[1]。目前關于腦出血的治療以服用降顱壓、降血壓、控制腦水腫等藥物為主，但缺乏針對性治療手段，多數患者仍存在神經功能缺損[2-3]。研究發現，腦出血發生后，神經元細胞繼發性持續死亡是導致神經功能缺損的重要因素，而小膠質細胞自噬是神經元細胞繼發性持續死亡的主要形式，同時也是影響神經功能恢復的重要因素[4]。因此，尋找有效抑制小膠質細胞自噬的藥物對臨床治療腦出血有重要意義。近年來，中醫藥在治療腦出血疾病中發揮重要作用。中醫認為腦出血的病因為瘀熱阻竅，故治療以活血散熱、散瘀止痛為主[5-7]。石菖蒲為天南星科植物，具有醒神益智、降火清痰、保護心肌細胞的功效。研究證實，石菖蒲有減輕腦出血后細胞腫脹，減輕腦水腫，保護腦組織的作用[8]，但關于石菖蒲腦保護的作用機制仍需要進一步探討。研究表明，趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)-磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路在小膠質細胞自噬過程中起重要調控作用[9]。因此，本研究建立腦出血大鼠模型，觀察石菖蒲通過CXCR4-PI3K信號通路對模型大鼠小膠質細胞自噬的影響及神經保護作用，為臨床治療腦出血疾病提供參考。

1 材料

1.1 動物健康雄性SD大鼠，8周齡，50只，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK(京)2018-0086。

1.2 藥物與試劑石菖蒲萃取物(長沙華康生物技術開發有限公司，粉末狀，批號：180507)。水合氯醛(廣州市虎傲化工有限公司，貨號：302-17-0)；多聚甲醛、氨水、二甲苯、乙醇、戊二醛、檸檬酸鉛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：C104190、A299541、X139941、E111994、G105907、L303843)；蘇木精染液、伊紅染液(德州潤昕實驗儀器有限公司，批號：180201、180604)；磷酸緩沖液(美國Sigma公司，貨號：P5368-10PAK)；醋酸雙氧鈾(海德創業生物科技有限公司，貨號：HD28000)；10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素(美國Hyclone公司，貨號：SH30088.02、SV30010、SV30079.01)；總RNA提取試劑盒(Trizol法)(美國Invitrogen公司，貨號：15596-018)；SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本TAKARA公司，貨號：DRR041A)；Taq Man反轉錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：QN0943)；鹽酸乙醇、RIPA裂解液(碧云天生物科技有限公司，貨號：C0165S、P0013C)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，美國Biovision公司，貨號：2119-10)；10×TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：T1081)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司，貨號：69-97682)；兔抗大鼠CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1、GAPDH一抗及山羊抗兔IgG(二抗)(美國Abcam公司，貨號：ab124824、ab154598、ab38449、ab207612、ab181602、ab6721)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 儀器腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀(北京普瑞麥迪實驗室技術有限公司)；ABI 7900型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；DYY-4C型電泳儀(上海巴玖實業有限公司)；ZPS0850型光學顯微鏡(蘇州瑞文光電科技有限公司)；CX23型電子顯微鏡(日本Olympus Corporation公司)。

2 方法

2.1 造模分組及藥物干預50只SD大鼠隨機取10作為假手術組，剩余40只采用Rosenberg法[10]建立腦出血大鼠模型，以350 mg·kg-1的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頭部固定于腦立體定位儀上，取正中部位，頭皮消毒，切口，用手術刀剝離骨膜，使其冠狀縫和前鹵裸露。前囟前2.0 mm，中線右側 3.0 mm 處鉆直徑為1.0 mm的圓孔，用微量注射器從股動脈抽取50 μL血液，以2 μL·min-1的速度將血液注射到圓孔內，留針5 min后出針，縫合傷口，消毒防止感染。以模型大鼠清醒后出現同側Horner征為造模成功標準，即沒有方向性的自主活動、提尾時自行向右轉圈、右前肢癱瘓或內收、曲頭朝向右側背部。36只大鼠造模成功，隨機分為模型組及石菖蒲低、中、高劑量組，每組9只。石菖蒲低、中、高劑量組以10 mL·kg-1體積腹腔注射 0.05 g·mL-1、0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1石菖蒲溶劑，假手術組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，每天1次，連續給藥7 d。

2.2 神經功能評估給藥干預7 d后，采用Garcia法[11]對各組大鼠進行神經功能評分，共6項測試：自主運動0～3分；活動對稱性0～3分；觸摸反應1～3分；金屬絲鼠籠攀援1～3分；前肢對稱性0～3分；觸摸雙側軀干反應1～3分，各項得分總和為神經功能評分，分數越低代表神經功能缺損越嚴重。

2.3 組織取材神經功能評分完成后處死大鼠，立即取出傷灶側大腦皮質。每組4只大鼠的大腦皮質放4%多聚甲醛中固定，剩余5只大鼠的大腦皮質放于-80 ℃保存，備用。

2.4 大腦皮質病理學觀察取出固定的大腦皮質，石蠟包埋，冠狀切片厚度4 μm，脫蠟，自來水沖洗，蘇木精染液染色2 min，自來水沖洗，0.5 %鹽酸乙醇液分化2 s，自來水沖洗，1%氨水返藍5 s，自來水沖洗，伊紅染液浸染1 min，自來水沖洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，光學顯微鏡下觀察，每張切片隨機選5個不同視野拍照。

2.5 大腦皮質小膠質細胞自噬的超微結構觀察取-80 ℃保存的大腦皮質，放4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中，4 ℃固定24 h，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液漂洗，3%戊二醛固定2 h，環氧樹脂包埋，冠狀切片，厚度約0.12 μm，用1 %醋酸雙氧鈾、0.2%檸檬酸鉛染色，電子顯微鏡下觀察小膠質細胞的超微結構。

2.6CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1mRNA相對表達量檢測取-80 ℃保存的大腦皮質，采用Trizol法總蛋白提取試劑盒提取總RNA，Taq Man反轉錄試劑盒獲取cDNA模版，參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書要求進行RT-qPCR擴增。擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火 35 s，72 ℃延伸1 min，設40次循環。以GAPDH為內參，2-△△CT法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 CXCR4、PI3K、AKT、Beclin-1蛋白相對表達量檢測取-80 ℃保存的大腦皮質，加入1 mmol·L-1RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，離心半徑10 cm，取上清，置沸水浴 10 min，再次離心取上清，BCA法進行蛋白定量，之后將蛋白放置于裝有沸水的燒杯中10 min，使其變性，蛋白變性后置冰上冷卻10 min。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣20 μL，100 V 電壓進行電泳、轉膜。轉膜完成后，將膜放5% BSA中封閉1 h，加入一抗(11 000)，4 ℃過夜，TBST清洗3次，加二抗(13 000)，室溫孵育 1 h，TBST清洗3次，將膜放入凝膠成像系統中掃描，Image 軟件分析目的條帶灰度值，目的條帶與內參條帶GAPDH灰度值的比值表示蛋白表達水平。

3 結果

3.1 石菖蒲對腦出血大鼠神經功能評分的影響與假手術組比較，模型組大鼠神經功能評分顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，石菖蒲低、中、高劑量組大鼠神經功能評分顯著升高(P<0.05)，其中石菖蒲高劑量組神經功能評分顯著高于中、低劑量組(P<0.01)，中劑量組神經功能評分顯著高于低劑量組(P<0.05)。提示石菖蒲能改善腦出血大鼠的神經功能。見表2。

表2 石菖蒲對腦出血大鼠神經功能評分的影響 分)

3.2 石菖蒲對腦出血大鼠腦組織病理學的影響假手術組大腦皮質細胞排列規則，胞核形狀均勻，細胞間隙正常；模型組腦組織病理損傷嚴重，細胞排列散亂，胞核固縮，細胞間隙增大；石菖蒲低、中、高劑量組腦組織病理損傷程度、細胞排列散亂程度均減輕，其中石菖蒲高劑量組減輕最明顯。提示石菖蒲能改善腦出血大鼠的腦組織病理狀態。見圖1。

注：A：假手術組；B：模型組；C：石菖蒲低劑量組；D：石菖蒲中劑量組；E：石菖蒲高劑量組圖1 石菖蒲對腦出血大鼠腦組織病理學的影響(HE染色，×400)

3.3 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質小膠質細胞自噬超微結構的影響假手術組未見明顯自噬細胞；模型組出現大量雙模結構的自噬細胞，含有多種被分解的殘余細胞器；石菖蒲低、中、高劑量組自噬細胞數量減少，其中石菖蒲高劑量組最少，但仍存在少量自噬細胞。提示石菖蒲能降低腦出血大鼠大腦皮質小膠質細胞的自噬。見圖2。

注：A：假手術組；B：模型組；C：石菖蒲低劑量組；D：石菖蒲中劑量組；E：石菖蒲高劑量組；紅色箭頭表示自噬細胞圖2 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質小膠質細胞自噬超微結構的影響(×10 000)

3.4 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質CXCR4-PI3K信號轉導通路相關基因相對表達量的影響與假手術組比較，模型組CXCR4、Beclin-1mRNA相對表達量顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，石菖蒲低、中、高劑量組CXCR4、Beclin-1mRNA水平顯著降低(P<0.05)，其中石菖蒲各劑量組間CXCR4、Beclin-1mRNA的水平均有顯著性差異(P<0.05)。提示石菖蒲能顯著抑制腦出血大鼠大腦皮質CXCR4-PI3K信號轉導通路的激活。見表3。

表3 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質CXCR4-PI3K信號轉導通路相關基因相對表達量的影響

3.5 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質CXCR4-PI3K信號轉導通路相關蛋白相對表達量的影響與假手術組比較，模型組CXCR4、Beclin-1蛋白表達量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，石菖蒲低、中、高劑量組CXCR4、Beclin-1蛋白表達量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平顯著降低(P<0.05)，且石菖蒲各劑量組間蛋白表達水平有顯著性差異(P<0.05)。提示石菖蒲能顯著抑制腦出血大鼠大腦皮質CXCR4-PI3K信號轉導通路的激活。見表4，圖3。

表4 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質CXCR4-PI3K信號轉導通路相關蛋白相對表達量的影響

注：A：假手術組；B：模型組；C：石菖蒲低劑量組；D：石菖蒲中劑量組；E：石菖蒲高劑量組圖3 石菖蒲對腦出血大鼠大腦皮質CXCR4-PI3K信號轉導通路相關蛋白相對表達量的影響

4 討論

腦出血是由非外傷性腦內血管破裂引起的，是腦血管疾病中致死率最高的疾病之一，腦出血患者3個月內的病死率達20%[12]。腦出血后血腫部位周圍發生繼發性腦損傷，產生神經元壞死，引發神經功能障礙[13-14]。目前對腦出血的主要治療手段有顱內壓治療及血壓控制，但上述手段不能盡快控制腦出血產生的繼發性損傷。越來越多的研究證實，細胞自噬與腫瘤的發生發展密切相關，過度自噬會導致細胞死亡，是許多腦損傷疾病產生的機制之一[15-17]。因此，尋找有效的治療藥物抑制細胞自噬，對治療腦出血疾病有重要意義。

石菖蒲是多年生草本植物，具有開竅、寧心安神、祛濕等功效?，F代藥理研究表明，石菖蒲具有保護神經元、調節中樞神經系統的作用[18-19]。ZHANG等[20]研究發現，石菖蒲能有效改善帕金森鼠的行為學能力。石菖蒲是破血逐瘀方中的主要中藥材，鐘建斌等[21]研究發現，破血逐瘀方聯合依達拉奉能降低腦出血血腫周圍組織水腫，改善腦出血患者的神經功能。陳璐等[22]研究發現，石菖蒲揮發油能抑制神經膠質瘤細胞自噬，進而保護大腦的神經功能。本研究發現，石菖蒲組大鼠的神經功能評分顯著高于模型組，腦組織損傷程度、細胞排列散亂程度以及細胞自噬程度均較模型組有所減輕，說明石菖蒲能有效改善腦出血大鼠的神經功能。

CXCR4是趨化因子基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)的特異性受體，SDF-1與CXCR4結合形成SDF-1/CXCR4信號軸，在腦出血導致的神經功能受損中發揮重要作用[23]。研究發現，誘導自噬蛋白Beclin-1參與腦出血引發的細胞內環境變化，對輕、中度腦出血有保護作用，但過度自噬會導致細胞死亡，是許多腦損傷疾病產生的機制之一[24]。PI3K磷酸化影響細胞自噬活動，SDF-1/CXCR4信號軸與PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路結合，可形成復雜的CXCR4-PI3K信號通路，在調控細胞自噬、修復神經和保護大腦等方面發揮關鍵作用[25-27]。HUANG等[28]研究發現，CXCR4抑制劑可以抑制小膠質細胞的遷移，改善腦出血大鼠的神經功能。仇至富等[29]研究發現，補陽還五湯能激活腦出血大鼠腦組織中CXCR4-PI3K信號轉導通路，抑制細胞自噬，進而調控細胞穩態，調節大鼠的神經功能。以上研究表明，CXCR4-PI3K信號通路參與調控細胞自噬并影響神經功能。本研究發現，石菖蒲可顯著降低CXCR4、Beclin-1mRNA及蛋白相對表達量及 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平，說明石菖蒲能通過CXCR4-PI3K信號轉導通路抑制細胞自噬，對腦出血引起的神經功能紊亂起保護作用。

綜上所述，石菖蒲能降低腦出血大鼠小膠質細胞自噬，改善大腦神經功能，可能是通過CXCR4-PI3K信號轉導通路發揮作用，為腦出血相關藥物研發及臨床治療提供參考。