蒼防湯對DSS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎保護作用研究*

李登云，顏國華，曹世霞，陳文霞，趙新永

鄭州工業應用技術學院，河南 鄭州 451100

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性、復發性強的胃腸道功能紊亂性疾病，屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)范疇。該病主要發生在結腸黏膜且病變多從結腸遠端發展，主要臨床表現以腹瀉、血便、黏液膿血便以及體質量減輕為主，重癥患者伴有高熱及中毒癥狀。本病反復發作、遷延難愈，嚴重影響患者生活質量[1-2]。流行病學調查顯示，潰瘍性結腸炎在歐美等國家較為常見，我國近年來的發病率也呈顯著上升趨勢。我國潰瘍性結腸炎的年患病率已達到2/10 000，與八十年代相比提高6倍[3-4]。現代研究認為，該病的發生是由帶有易感基因和腸道內菌群相互作用導致的，這些易感基因都與免疫系統有關。遺傳易感者的致病因素會激活免疫系統引發炎癥反應，中性粒細胞、單核-巨噬細胞及T淋巴細胞參與UC發生發展的不同階段，它們釋放的各種炎癥因子如白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)是公認的介導UC的促炎因子[5]，這些炎性因子均可引起結腸黏膜的損害，導致UC的發生[6]。正常情況下腸道黏膜表面與腸道管腔之間存在一道天然免疫屏障——黏液屏障，對腸黏膜起到保護作用。構成結腸組織黏液屏障的主要成分是杯狀細胞分泌的一種黏蛋白(mucins，MUC)，其中MUC2是結直腸中最主要的分泌型黏蛋白，也是結腸黏液層中最主要的成分，對炎癥性腸病的發生、發展和愈合起重要作用[7]。

臨床上用于治療UC的藥物主要包括氨基水楊酸類、免疫抑制劑類、糖皮質激素類及微生態制劑等[8]。這些藥物在治療UC中都起到了很好的治療作用，但是它們的不良反應時有報道[9-10]。因此，尋找新的治療作用顯著且副作用小的藥物迫在眉睫。

中醫認為，UC屬于中醫上“腸澼”“痢疾”“饗泄”以及“小腸泄”等范疇，基本病機為濕熱蘊腸、氣滯絡瘀，病位主要在大腸，發病基礎為脾虛失健。蒼防湯出自《素問病機氣宜保命集》，“蒼術去皮，四兩，麻黃去根節，四兩，防風去蘆頭，五錢。上為粗末，每服一兩，生姜七片，水二盞，煎至一盞，去滓溫服”。該方全稱蒼術防風湯，原為治“饗泄”而設，主治脾失健運而致飧泄、完谷不化之癥，現在多用于痢疾、痹證等風寒濕阻型病癥，在原方中加入白術增強其健脾祛濕的效果。目前，關于蒼防湯在治療UC的療效以及機理方面還未見公開報道。因此，本研究通過DSS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型，來闡明蒼防湯治療UC的作用及其機理，為臨床治療UC提供現代分子生物學基礎。

1 材料

1.1 動物12周齡SPF級SD雄性大鼠100只，體質量300～350 g，購于鄭州大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(豫)2010-0002。飼養條件：溫度(22±2) ℃，濕度(45±10)%，光/暗循環12 h/12 h。鄭州工業應用技術學院倫理委員會批準本研究涉及的動物實驗，編號：2020-010。

1.2 藥物與試劑柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP，上海信宜制藥公司，批號：H31020668)；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS，上海翊圣生物科技有限公司，貨號：60316ES25)；HE染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司，貨號：C0105)；Cleaved caspase-3、MUC2抗體(CST公司，貨號：9664、3033S)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、硝酸纖維素膜(北京索萊寶科技有限公司，貨號：PC0020、YA1711)；兔二步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：PV9001、ZLI 9018)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技術有限公司，貨號A0208)；Trizol(美國Invirogen公司，貨號：15596026)；熒光PCR試劑盒(美國Taqman公司，批號：A15869)；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 儀器CX21型生物顯微鏡(日本Olympus Corporation公司)；DYC-Mini1型垂直蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；FD-1C-80型冷凍干燥機(北京博醫康技術有限公司)；Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；H2500R-2型低溫高速離心機(離心半徑：22.5 cm，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；GelDoc EZ型免疫印跡分析儀(美國Bio-Rad公司)；752N型紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；7500型熒光PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 藥物制備取蒼術180 g，防風 150 g，麻黃 60 g，白術150 g，生姜90 g。去離子水覆蓋藥材，浸泡并常規煎煮，80目過濾網過濾，收集濾液，其剩余藥材加入適量去離子水再次煎煮。合并兩次所得濾液，通過冷凍干燥制成凍干粉備用。所有中藥材均購于亳州市中藥材市場。

2.2 動物模型100只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性組、蒼防湯低、高劑量組，每組20只。大鼠饑餓12 h后(斷食不斷水)，恢復正常飲食，并給予5.0%的DSS無菌水溶液，連續5 d，建立UC模型[11-12]，正常組大鼠正常飲水。第6天，大鼠出現腹瀉、大便出血、體質量明顯下降等癥狀，停止DSS飲水，給予大鼠正常飲水并灌胃給藥，陽性組大鼠給予0.67 g·kg-1SASP，蒼防湯低、高劑量組分別給予1.0 g·kg-1和10.0 g·kg-1的蒼防湯凍干粉溶液，正常組大鼠給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續治療2周。

2.3 一般指標檢測用藥開始后，每天測量大鼠體質量、觀察糞便及便血情況，根據觀察情況計算疾病活動指數(disease activity index，DAI)。體質量下降：<1%計0分，1%～5%計1分，6%～10%計2分，11%～15%計3分，>15%計4分；便血：陰性計0分，陽性計2分，嚴重出血計4分；糞便形成：正常計0分，便溏計2分，腹瀉計4分。實驗結束后，切除其結腸，并根據Minaiyan等[13]的研究在顯微鏡下觀察結腸組織創面大小和炎癥程度并計分。潰瘍創面：無潰瘍計0分，<3 mm計1分，>3 mm計2分；炎癥計分：無炎癥計0分，輕度炎癥計1分，重度炎癥計2分。根據結腸組織潰瘍創面計分和炎癥計分，計算腸黏膜損傷指數。損傷程度評分：未損傷黏膜層計0分；損傷黏膜下層計1分；損傷黏膜肌層計2分；損傷漿膜層計3分。

2.4 HE染色觀察結腸組織病理變化4%多聚甲醛固定結腸組織，95%乙醇脫水，石蠟包埋，切成 5 μm 厚切片，脫蠟，蒸餾水清洗，蘇木精染色1 min，鹽酸乙醇分化3 s，蒸餾水沖洗，氨水返藍，伊紅素復染2 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片，置顯微鏡下觀察。

2.5 免疫組化檢測結腸組織細胞凋亡情況嚴格按照試劑盒說明操作：切片常規處理后，用pH 6.0、10 mmol·L-1檸檬酸鈉緩沖溶液高壓鍋內蒸煮 15 min 進行抗原修復，3%H2O2封閉10 min，清洗，5% BSA封閉，加入一抗(11 500)，4 ℃過夜，PBS清洗，室溫下加入二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色 5 min，鹽酸乙醇分化，復染，梯度脫水，二甲苯透明并封片，顯微鏡下觀察。

2.6 定量PCR檢測結腸組織中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ及MUC2的mRNA水平每組取1 g結腸組織，勻漿，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄成cDNA。PCR反應體系：上下游引物各0.5 μL，5×PCR buffer 10 μL，dNTPs 0.5 μL，Tap酶1 μL，cDNA模板5 μL，補加雙蒸水至50 μL。擴增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40個循環。實驗以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法 計算目的mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot 檢測MUC2蛋白的表達水平取15mg新鮮結腸組織于1.5 mL試管內，加入含100 nmol·L-1蛋白酶抑制劑的 RIPA組織裂解液300 μL，用超聲粉碎儀打碎混勻，13 000 rpm·min-1離心15 min，吸取上清液，用BCA測定試劑盒測定總蛋白含量。取50 μg蛋白用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉至于硝酸纖維素膜，PBS洗3次，5%BSA室溫封閉1.5 h，分別加入MUC2(11 500)及β-actin(12 000)一抗，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，加入HRP標記的山羊抗兔二抗(15 000)，室溫孵育1.5 h，Pierce ECL Plus發光液顯影，每組獨立灰度掃描3次，以β-actin為內參蛋白，分析目的蛋白條帶灰度值[14]。

3 結果

3.1 蒼防湯對大鼠疾病活動指數、腸黏膜損傷指數及損傷程度評分的影響與正常組相比，模型組大鼠DAI、腸黏膜損傷指數及損傷程度評分均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，蒼防湯低、高劑量組大鼠DAI、損傷指數及損傷程度評分均明顯降低(P<0.05)。提示蒼防湯可明顯減輕潰瘍性結腸炎的結腸損傷程度。見表2。

表2 蒼防湯對潰瘍性結腸炎大鼠DAI、腸黏膜損傷指數及損傷程度評分的影響

3.2 蒼防湯對結腸形態學的影響與正常組大鼠結腸組織相比，模型組大鼠結腸組織中出現明顯的潰瘍和炎癥，組織結構被破壞，可見大量深染的白細胞和淋巴細胞；與模型組相比，蒼防湯組大部分上皮細胞和隱窩損傷被修復，結構趨于恢復正常，炎癥浸潤基本消失。提示蒼防湯能夠抑制結腸炎癥，減輕結腸組織損傷。見圖1(箭頭所指為損傷處)。

3.3 蒼防湯對結腸細胞凋亡的影響與正常組比較，模型組大鼠結腸組織中陽性細胞較多(染色為深褐色，黃色箭頭所指)；與模型組相比，蒼防湯組陽性標記的細胞顯著減少，幾乎觀察不到。表明蒼防湯可以劑量依賴性地降低DSS誘導的結腸細胞凋亡。見圖2。

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性組；D：蒼防湯低劑量組；E：蒼防湯高劑量組圖1 蒼防湯對結腸形態學的影響(HE染色，×100)

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性組；D：蒼防湯低劑量組；E：蒼防湯高劑量組圖2 蒼防湯對結腸細胞凋亡的影響(×100)

3.4 蒼防湯對結腸中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ及MUC2mRNA表達水平的影響與模型組相比，蒼防湯低、高劑量組均能顯著降低結腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達水平(P<0.05)，顯著升高IL-10及MUC2的mRNA表達水平(P<0.05)，其中高劑量蒼防湯的作用更為明顯。表明蒼防湯可劑量依賴性地改善炎癥相關因子及MUC2的mRNA表達。見表3。

表3 蒼防湯對結腸組織中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和MUC2 mRNA表達水平的影響

3.5 蒼防湯對結腸組織中MUC2蛋白表達的影響與模型組比較，蒼防湯顯著升高結腸組織中MUC2的蛋白表達量(P<0.01)。結果見圖3，表4。

注：A：正常組；B：模型組；C：陽性組；D：蒼防湯低劑量組；E：蒼防湯高劑量組圖3 蒼防湯對結腸組織中MUC2蛋白表達的影響

表4 蒼防湯對結腸組織中MUC2蛋白表達的影響

4 討論

潰瘍性結腸炎是一種慢性炎癥性腸病，雖然對其進行了大量研究，但目前其發病機制還不清楚[15]。這種疾病往往遷延不愈，而臨床中那些難治的、癥狀嚴重的患者，有時須通過手術來治療[16]，但手術存在損傷大、易復發等問題。因此，探索其他新的治療方式，對于其臨床治療具有重要意義。中藥作為傳統藥物，在治療UC上顯示出良好效果[17-18]。蒼防湯具有解散風邪、通行滯氣、健脾燥濕之功效，常用于治療“饗泄”。本研究通過復制潰瘍性結腸模型，探索蒼防湯對其的治療效果，結果發現蒼防湯可顯著減輕模型大鼠的癥狀，提示蒼防湯治療UC 的有效性。

結腸環境在潰瘍性結腸炎的進程中扮演著重要的角色。在UC患者和DSS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型中，結腸組織中促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6 及IFN-γ的水平顯著高于正常組，而IL-10和MUC2的水平顯著降低[19-20]。在DSS誘導的大鼠模型中，當阻斷大鼠表達IL-6時，T細胞和B細胞活化鈍化，腸道炎癥相應減少，可抑制UC的發展[21-22]。研究表明，有效抑制結腸組織中TNF-α或其他相應炎癥因子的釋放都可以對潰瘍性結腸炎患者起到治療作用[21，23]。研究發現，對UC有效的藥物大多能夠促進MUC2蛋白的表達和分泌，而MUC2的表達和分泌可改善病人的相應癥狀[24]。

本研究發現，給予蒼防湯后，大鼠結腸組織中的炎癥反應顯著減輕，細胞凋亡減少，說明炎癥損傷得到有效抑制。對結腸組織中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平檢測發現，蒼防湯能顯著降低促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ表達水平，升高抑炎因子IL-10的表達，增加黏膜屏障蛋白MUC2的表達，這與我們前期研究結果一致[12]。現代藥理學研究也發現，蒼防湯配方中的某些單味藥對炎癥性疾病有良好的作用，如蒼術可通過抑制胃組織中TNF-α、IL-6、IL-1的mRNA的表達水平，降低血液中TNF-α、IL-6、IL-1 的含量，達到治療胃潰瘍的作用[25-26]；防風可以抑制COX-2的活性，從而降低TNF-α、IL-1和IL-6的分泌，減輕大鼠風濕性關節炎和肌痙攣[27]；麻黃可抑制肺部炎癥細胞的浸潤及TNF-α、IL-6、IFN-γ的分泌，減輕香煙誘發肺部炎癥反應[28]。這些單味中藥在不同的炎癥疾病中，在一定程度上可通過調節炎癥介質而抑制炎癥反應。

綜上，蒼防湯可明顯改善DSS誘導的潰瘍性結腸炎，其作用機理可能是抑制炎癥介質的表達，促進保護性黏蛋白的增加，從而減輕結腸炎癥反應，降低結腸組織損害。